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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 단백질띠가 안보여요 ㅠㅠ
알지이니(대학원생)  | 07.10 22:46
첨부파일 파일첨부: 10sec.2.jpg (35 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요  웨스턴 블랏 실험중인 대학원생입니다

지금까지 3번정도 웨스턴을 진행하고 있는데 베타엑틴은 비교적 잘 나오는데 cleaved caspase-3,-9이 나오지 않아서요,, 단백질은 휴먼세포에서 정량했고 로딩은 40ug으로 진행하였습니다 

1차 안티바디는 처음에 1000:1로 하였는데 백그라운드가 너무 진해서 이번에 2000:1로 처리하였습니다. 더 많이 희석하나 적게하나 띠가 안보이는거는 똑같습니다..

2차안티바디는 5000:1로 하였구요 host랑 다 맞게 확인해서 진행하였습니다.

블로킹은 5% BSA(TBS)로 1시간 하고 워싱은 TBST로 5분마다 3번 진행하고 1차안티바디는 2000:1로 희석해서 4도씨에 O/N시켯습니다. 그후 같은 조건으로 워싱하고 2차안티바디 5000:1로 1시간 R/T 후 워싱 후 측정하였습니다..

 

원래 cleaved caspase라인이 웨스턴 하기 힘든가요 ? ㅠㅠ

무엇이 문제일까요 ,, 도와주세요 

#western blot
 
#membrane
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리BlackSmile  |  07.11 03:41  

Cleaved caspase를 본다는 말은 cell에 어느정도 apoptosis가 일어나는지 살펴본다는 건데, 혹시 저 cell에 어떤 drug같은 거를 처리해서 MTT assay같은 걸로 viability가 떨어지는 것을 확인해본 적이 있으신가요?

왠지 왼쪽 band가 actin같은데, actin이 저정도인데 cleaved caspase가 관찰되지 않는다는건

1. Antibody가 상태가 안좋아서 caspase를 detect하지 못하거나

2. 원래 저 cell은 cleaved caspase가 없거나

둘 중 하나일 가능성이 높다고 생각합니다.

개구리금상품권  |  07.15 22:09  

한번은

조금 어려운 세포에서 

 cleaved caspase3를 detection을 위해

셀 수 없는 WB를 했던 기억이.....

 

윗분의 말씀처럼 유도가 되었는지, 

되지 않았는지, 

또는 실험적인 오류가 있었는지 알기 어렵습니다. 

특히나  cleaved caspase family는 detection 하기 힘듭니다. 

 

이때 사용할 수 있는 control 들이 있습니다. 

staurosporine 같은 시약이 있습니다. 

 

또한 CHAPS 같은 buffer로 lysis를 하고, 

loading도 80ug 까지 올려도 보시는걸 추천드립니다. 

 

그리고 full form도 함께 보면 더 좋습니다. 

 

알hyun11  |  07.23 22:56  
저는 cleaved caspase 3 를 봤었는데요 제 경우에는
밴드가 진하게 뜰려면 셀에 약물을 치던가 해서 셀이 죽어서 뜰정도가 되어야 하고 죽어서 뜬셀까지 모두 harvest 합니다. 저도 단백질 40~50ug정도 걸었구요
제가 사용한 안티바디는 셀시그날링이었는데 1:500 으로 skim milk에 희석하여 4도씨 오버나잇 했어요
안티바디 따라서 skimmilk냐 BSA냐에도 영향이 큰 경우가 있습니다. 워싱이나 2차안티바디 붙이는 부분은 이상없어 보입니다. 부디 참고가 되시길..
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