[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
실험 테크니션 설문결과
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 282  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 his-tag 정제 중 non-specific 밴드 elution 때문에 질문드립니다.
뒷다리해징(대학원생)  | 07.10 17:16
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20200710_164030529.jpg (387 KB)
이미지 첨부파일

녕하세요. 신생 랩 석사과정 학생입니다.

단백질 정제는 처음에다가 여쭤볼 선배가 없어서 고수님들 조언을 얻고자 글을 올리게 되었습니다.

제 단백질의 크기는 173 kDa이고 thermo 사의 hispur-ni nta resin을 사용하여서 정제를 진행하였습니다.

버퍼는 thermo 사의 프로토콜 그대로

equilibration buffer: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl (PBS) with 10 mM imidazole ; pH 7.4

Wash buffer : PBS with 25 mM imidazole ; pH 7.4

Elution buffer : PBS with 250 mM imidazole ; pH 7.4 로 사용하였습니다.

1번레인 사이즈마커, 2번 non-binding, 3번 wash 1번후, 4번 wash 마지막,

5번 elution 입니다.

elution을 보면 타겟 밴드 사이즈 쪽에도 밴드가 두개가 보입니다.. ㅠㅠ 분해 된걸까요..? 하단에 보면 잡밴드들도 많이 보이구요.. wash는 진짜 충분히 진행하였습니다..

Q1. 제 enzyme을 좀 더 잃는다고 쳐도 wash할때 이미다졸 농도를 높여서 wash 해야 할까요?

Q2. 아니면 his-tag 정제 후 ion exchange chromatography를 진행하여야 할까요??

Q3. 조금 논외 질문이긴한데.. 혹시 다른 정제 중인 제 타겟 단백질이 wash때도 조금 용출되는 것 같은데 elution 시 잡밴드들이 같이 elution 되면 그때는 wash 이미다졸 농도를 높이면 제 단백질이 너무 loss 될까요?

단백질 정제를 혼자 진행하다보니 너무 어렵습니다 ㅠ...

고수님들 조언해주시면 정말정말 감사하겠습니다..

진도가 안 나가 교수님께 혼만 나고 있습니다..

#단백질
 
#정제
 
#his-tag
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.10 18:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

5번이 elution인가요?

정제 전과 non-binding 전기영동 결과는 없나요?

단백질 정제는 loss 없이 정제가 불가능합니다.

정제 원칙은 최소 loss, 최대 purity를 얻는 겁니다.

정제 방법은 정해진 것은 아니고 단백질 마다 최적 조건을 찾아서 해야합니다.

thermo protocol은 하나의 예로 생각하는것이 좋고  protocol대로 해서 잘 나오면

좋은데 잘 안나오면 최적 조건을 찾아서 정제해야 합니다.

NTA column의 최적화는

1. resin양 vs  단백질 양

2. wahisng 농도

3. elution 농도

위 3가지에 대하여 최적화해야 합니다.

최적화 조건은 각 조건별로 받은 reaction을 전기영동 해서 제거되는 단백질과

목적 단백질의 회수 패턴을 보고 결정하면 됩니다.

IEX를 진행 할 경우 목적 단백질의 pI는 알고 제거해야할 단백질들의 pI는

모르기 때문에 예비 실험을 해서 최적 조건을 찾아야 합니다.  

IEX 조건 최적화는 평형화 버퍼의 농도, pH, elution NaCl 농도 등에 대하여

확인해야 합니다.

뒷다리해징  |  07.10 18:24  

스피드님 매번 정말 감사드립니다!!

혹시 sds 겔 사진 상에서 180 kda 사이즈 근처에 밴드가 두개인데.. 이게 그 짧은 시간에 분해되어 두개로 보일 수도 있나요..???

저는 제 단백질 173 kDa에 하나의 밴드를 예상했었는데.. 밴드가 두개 보여서 어디선가 잘못 되었나 해서요..ㅠ

대왕개구리SPEED  |  07.10 18:27  

답뱐에도 얘기 했지만 정제전, non-binding, elution 시료의 전기영동 사진을

봐야 정확히 알수 있습니다.

뒷다리해징  |  07.10 18:35  

2번 레인이 cell extract, 3번이 non-binding, 마지막이 elution 사진 입니다!!

이 겔로는 확인이 불가능 할까요?!

대왕개구리SPEED  |  07.10 18:59  

질문에는 lane번호가 다른데 어느것이 진짜인가요?

뒷다리해징  |  07.10 22:08  

죄송합니다 ㅜㅜ 제가 질문에 잘못 적었어요 ㅜ

2번이 cell 깬 후 원심분리한 상등액,

3번이 non-binding, 4.5번이 wash, 6번이 elution입니다!!

대왕개구리SPEED  |  07.10 22:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

아래 사진에서 보듯이 정제가 잘못되었는지 target protein 분자량을 잘못

알고있는지 모르겠네요.

elution에서 보이는 180Kda 위에 있는 3개 band는 non-binding에도 있는 단백질

입니다.

또한 target 분자량 위치에 elution에는 단백질이 안보입니다.

우선 분자량이 안맞기 때문에 확인을 위해서는 재조합 단백질이라면

Hos cell(+empty vector) lysate와 발현 cell lysate의 전기영동 사진을 확인해야

할것 같습니다.

target protein위치를 정확히 확인 할 필요가 있을 것 같습니다.

upload_image

뒷다리해징  |  07.10 23:40  

발현해서 host와 비교해 보았을 때는 차이나는 밴드가 보여서.. 저것이라고 생각했습니다.. 겔이 똑바로 안 내려가서 조금 차이가 난다고 생각만 하였었는데.. 호스트+인서트 시퀀싱 결과로 확인했을땐 이상이 없었구요 ㅠㅠ 어떤 것을 해야 정확히 알 수 있을까요?

upload_image

대왕개구리SPEED  |  07.11 10:46  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

발현 조건 검토한 전기영동을 보니 173kd가 아니라 아래 red box에 안의

단백질 처럼 180kda 이상이 목적 단백질 인것 같습니다.

따라서 elution fraction에 있는 180kda 이상 단백질 3개는 분해 된것이 아니라

처음부터 lysate에 있던 단백질 입니다.

upload_image

 

 

 

 

뒷다리해징  |  07.11 22:07  

스피드님 갑자기 제가 뭔가를 잘못했나 싶어서 걱정이 되는데요..ㅠㅠ 제가 목적 유전자를 클로닝해서 단백질 발현을 시키면 밴드가 하나만 나와야 하는 것이 아닌가요..?! 여러개가 나올 수도 있나요?ㅠㅠㅠ 잘못 된 것일까요?

대왕개구리SPEED  |  07.11 23:19  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cloning이 잘못된것 보다 marker 문제로 보입니다.

정제를 해 보면 1개 단백질이 나올것으로 보이고 분자량 보다 정제 최적 조건을

찾는것이 중요할 것 같습니다.

뒷다리해징  |  07.12 02:20  

스피드님 정말 항상 많은 도움 받고 있습니다!

정제 조건을 잘 찾아서 좋은 결과 얻어보도록 하겠습니다!!

복 받으실 거예요 ㅠㅠ 감사합니다!

답변하기
할인행사 광고 검색광고
바이오디 바이오디
Wet 방식의 장점에 속도와 편리함까지 지닌 eBlot & eStain 파격 할인 (8.31까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 할인 행사 (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
nanoString & COVID-19 / 다양한 Cloning application에 적용 가능한 com... (8.27까지)
케이비티 케이비티
[KBT] Thermo Shaker, Sonicator, Mixer, Heating Block, Rotato.. (8.16까지)
브래디 브래디
초저온라벨 등 실험실용 풀칼라프린터 (COVID-19 안전사인 지원) (8.30까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN] Reading과 형광 Imaging을 하나의 장비로 한 번에!! [Multi-mode micr.. (8.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
qPCR/PCR 셋업을 자동분주기로 개선해보세요. : epMotion5070PCR (8.8까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
6/6  좌우
139,000132,100
482,000
47,20044,900
493,000
739,000702,100
109,000
143,800136,700
125,500119,300
136,000129,200
79,50075,600
370,000
130,500124,000
66,50063,200
93,20088,600
773,000734,400
92,30087,700
49,000
52,60050,000
17,000
23,000
339,400322,500
6,000
482,000
468,000
최근등록   더보기 >
탄수화물 소화실험에서 무엇을 측정하면 될까요?   08.04
western blot으로 특정 인자 band만 계속 안나옵니다 (bcl-2 보신 분 도움...   08.04
WB sample 농도   08.04
마우스 임신 test기   08.04
primer, probe 만들 gene 선택   08.04
genomic DNA extraction 과정 중에   08.04
11,000 bp와 12,000 bp의 vector를 전기영동으로 구분할수 있을까요 ?   08.03
cell seeding시 swirl 과 deposition 이라는 표현   08.03
3T3-L1과 RAW 264.7 cell의 GAPDH primer   08.03
용액 온도를 동시에 잴 수 있는 hot plate가 있을까요?   08.03
라이카코리아
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크