실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
his-tag 정제 중 non-specific 밴드 elution 때문에 질문드립니다.
레벨5 해징 (대학원생)
녕하세요. 신생 랩 석사과정 학생입니다.
단백질 정제는 처음에다가 여쭤볼 선배가 없어서 고수님들 조언을 얻고자 글을 올리게 되었습니다.
제 단백질의 크기는 173 kDa이고 thermo 사의 hispur-ni nta resin을 사용하여서 정제를 진행하였습니다.
버퍼는 thermo 사의 프로토콜 그대로
equilibration buffer: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl (PBS) with 10 mM imidazole ; pH 7.4
Wash buffer : PBS with 25 mM imidazole ; pH 7.4
Elution buffer : PBS with 250 mM imidazole ; pH 7.4 로 사용하였습니다.
1번레인 사이즈마커, 2번 non-binding, 3번 wash 1번후, 4번 wash 마지막,
5번 elution 입니다.
elution을 보면 타겟 밴드 사이즈 쪽에도 밴드가 두개가 보입니다.. ㅠㅠ 분해 된걸까요..? 하단에 보면 잡밴드들도 많이 보이구요.. wash는 진짜 충분히 진행하였습니다..
Q1. 제 enzyme을 좀 더 잃는다고 쳐도 wash할때 이미다졸 농도를 높여서 wash 해야 할까요?
Q2. 아니면 his-tag 정제 후 ion exchange chromatography를 진행하여야 할까요??
Q3. 조금 논외 질문이긴한데.. 혹시 다른 정제 중인 제 타겟 단백질이 wash때도 조금 용출되는 것 같은데 elution 시 잡밴드들이 같이 elution 되면 그때는 wash 이미다졸 농도를 높이면 제 단백질이 너무 loss 될까요?
단백질 정제를 혼자 진행하다보니 너무 어렵습니다 ㅠ...
고수님들 조언해주시면 정말정말 감사하겠습니다..
진도가 안 나가 교수님께 혼만 나고 있습니다..
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