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Agouti
(비회원)
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20.07.10 13:40
PCR genotyping인듯.
PCR 반응이 잘되지 않으면 위 사진에서 처럼 smear 하게 나타납니다.
Template DNA, PCR 시약 어느쪽의 문제인지 모르겠네요.
새로 준비한 tail DNA와 새로 개봉한 PCR 시약으로 다시 도전.
안녕하세요
보통 PCR band가 보이지 않은 원인에는 여러가지가 있습니다.
1. Polymerase 활성 문제 - Polymerase 종류를 바꿔서 재실험을 해보시는 것도 하나의 방법입니다.
2. Annealing 온도 - annealing 온도가 높을 경우 primer가 재대로 template에 binding 하지 못하기 때문에 PCR 반응이 진행되지 않을 수 있습니다. Annealing 온도를 낮춰보는도 방법입니다.
3. Primer 디자인 - primer가 target template와 상보적인 서열이 짧을 경우에도 PCR 반응이 진행되지 않을 수 있습니다.
4. 기타 문제 - 보통 buffer는 오래보관해도 크게 이상이 없습니다만 dNTP 같은 경우 얼렸다 녹였다를 많이 반복하면 degradation의 문제가 있을 수 있다고 합니다. 첨가물들을 새롭게 준비하여 PCR을 해보시는 것도 좋을 것 같습니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.07.10 16:12
답변 감사 합니다. PCR 기계는 정해져 있어서 수정 하기는 불가능 합니다.
dNTP 역시 얼렸다 녹인 상태에서 믹스 합니다.
재고가 많아서 냉동실에 얼려두고, 찾아서 쓰기는 합니다.
다음에 할 때는 새로 주문 한 것으로 해봐야 겠네요.
그러면 혹시DNA 농도를 밴드에 보일 정도로 잘 녹여져 나올 수 있는 방법이 있을까요?
버퍼 A-25mM NaOH, 0.2mM EDTA 50ml
버퍼 B-40mM Tris-HCl ph 5.5 입니다.
먼저 버퍼 A 100ul 각 큐브에 분주 후 마우스의 꼬리를 잘라서
텝핑하여 꼬리가 잘 시약에 담가지게 한뒤
100도에서 1시간 동안 히팅 시킵니다.
그리고 1시간이 지나면 얼음에 10분 박아 두고
버퍼 B 100ul 추가하여 볼텍싱 1분 동안 진행하고
13,0000rpm으로 10분 4도에서 진행 후
상층액으로 2ul DNA+믹스쳐 최종 20ul 피펫팅 한 후
PCR 진행 합니다. 106도에서 진행 시작 하구요.
95도-95도-65도-68도--goto-95도- 60도 순서 입니다.
1시간 30분 정도 걸립니다.
꼬리는 아주아주 작게 잘라도 이론적으로 DNA가 나옵니다.
일단 몇 가지 지적을 드리겠습니다.
밴드를 찍고 나면 밴드 부분은 희게, 밖은 좀더 어둡게 뜨게 초기 설정? 이 되어 있습니다만, 일반적으로 밴드를 관찰할때는 흑백 반전을 합니다. 옅은 smearing 현상 등을 판단하려면 반전시켜서 보는 게 낫고 보통 논문에도 그렇게 밴드를 실죠. 그리고 밴드도 좀더 선명하게 보이게 contrast 변화시키는 방법을 익혀 보세요. 물론 지금 제대로 나온 상황은 아니시지만 250bp 부분에 약간의 희미~한 밴드가 있긴 한데 컨트래스트 올리면 보일만도한데요
smearing 현상에는 여러 원인이 있지만 "template이 너무 많은 경우" 도 하나의 원인이 됩니다. PCR 반응에 대해서 말씀드리자면, 무조건 초기 DNA가 많다고 반응이 잘되는 게 아닙니다.
선생님이 쓰는 PCR 관련 polymerase, dNTP, 등등 제품에는 규정된 용량이 있고 그대로 맞춰 넣으시면 됩니다. 아마 박사님께 컨펌 받으셨다니 이상하지 않으리라 보지만 그럼에도 불구하고 다시 점검해 보십시오.
일반적으로 20ul 정도의 반응용액 기준으로 template(꼬리녹인 용액) 1~2ul, primer 10mM 1ul*2종류(F,R), 기타 mixture 용량 맞춰서 제품 카탈로그 대로 넣으면 될거고요.
본문에는 4ul 넣는다고 하고 댓글엔 2 넣는다고 했는데 2정도가 맞아 보입니다.
그리고, DNA가 안나온다고는 저 것만 보고는 아무도 말할 수 없습니다....제가 이전에 한번 게시글에 댓으로 단 거 같은데, DNA가 나온 것을 확인하려면 반응하지 않은 채로 대량의 template을 바로 겔에 걸어서 확인해서 10000 이상의 큰 bp의 (겔 최상단) 밴드를 확인하는 방법이 좋습니다.
버퍼를 새로 만든것은 잘한 일이긴 한데, 아주 critical한 프로세스는 아니라고 생각합니다. 밴드가 희미하게라도 나온다면 미세 조정이 필요할거 같고, 저 250 쪽이 정상적인 밴드가 아니라면 프라이머 문제부터 다시 체크해 봐야 겟네요. 프라이머는 정상적인가요?
PCR setting에서 온도 뿐 아니라 시간도 잘 점검해 보세요. 그리고 65도는 어떻게 정한 온도인가요?
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.10.16 10:43
65도는 NMNAT3 사이클을 돌리는데 정해져 있었던 사이클
annealing 입니다.