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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 단백질 발현을 했는데요.
올챙이힘들다석사(대학원생)  | 07.08 21:24

단백질 발현을 해서 농도가 높게 나왔는데

활성이 안 좋은 이유가 무엇일까요??...

지금은 졸업하신 선배의 실험을 재현해보고 있는데

그 선배의 결과에서 기질의 전환율이 50% 정도가 나왔는데

제가 정제한 후에 실험을 재현해보니 전환율이 8% 밖에 나오지 않았습니다.....

왜 그런걸까요.....도와주세요...(정확하지 않더라도 이렇다라고 하는 이유 몇가지만 알려주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ)

현재 실험실 선배랑 같이 실험을 하고 있는데...그 분이 너무 구박을 합니다....

너무 힘들어요...왜 그런지 알아서 빨리 수정하고 싶습니다...

그 분이 구박하을 매일 같이 하시고 본인은 반응할 때만 잠깐하시고....

제가 발현부터 정제까지 모두하고 결과도 확인하는데.....계속 제 탓만 하시고 반응할 때 양도 어떻게 하는 지 알려주지 않으시고.......잘못이 저한테만 있다고 하시니 답답할 따름입니다..........

#protein
 
#in vitro
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.08 21:35  

구체적인 내용이 전혀 없기 때문에 이유를 찾기가 힘듭니다.

1. 현재 단백질 정제도는 몇 % 인가요?

2. soluble 상태로 발현된 단백질 인가요?

3. 정제는 어떤 step을 거쳐서 진행했나요?

4. 전환률 50%의 단백질과 8%의 단백질의 정제도는 동일한 %를 가지고

비교한건가요?

올챙이힘들다석사  |  07.08 21:50  

SPEED 님의 질문에 대해서 답변을 해드리면요....ㅠㅠㅠ

 

구체적인 내용이 전혀 없기 때문에 이유를 찾기가 힘듭니다.

1. 현재 단백질 정제도는 몇 % 인가요?

정제도가 몇 %인지는 잘 모르겠습니다... 확인을 어떻게 하는 건가요??...ㅠㅠ

다만 잘 된다고만 알고 있습니다. 적은 양을 정제해도 SDS-PAGE 상 진하게 나오고 제가 정제를 했을 때는 300ml 정도 sonicator로 깬 후 브래드 포드로 농도를 확인해 봤을 때 21mg/ml 정도 나왔습니다. 그 걸로 실험을 진행했었는데 결과를 보시더니 100ml만 정제해서 실험을 진행해보자고 하셨습니다. 이 때는 농도를 측정하지 않고 실험을 진행하셨습니다.

 

2. soluble 상태로 발현된 단백질 인가요?

넵 이전에 선배가 soluble한 상태로 발현된 cell을 이용했구요. 저 역시 발현 후 SDS-PAGE를 내려 정제되는 것을 확인했습니다.

 

3. 정제는 어떤 step을 거쳐서 진행했나요?

100ml 발현한 cell을 정제한다고 했을 때

1) cell down된 cell에 buffer를 약 7ml 정도 넣고 vortexing으로 섞어 주었습니다.

2) 19720Hz, power 25%, 깨는 시간 10 sec, 쉬는 시간 20 sec 씩 해서 총 15분을 진행했습니다.(얼음 존재하에 진행하였고, cell이 녹아 있는 용액이 깨기 전보다 색이 투명해졌습니다.)

3) 그 후 4도 원심분리기에서 원심분리하여 상층액을 resin 1ml에 넣어 1시간정도 흔들어 주면서 binding을 시켰습니다(binding은 상온에서 진행하였습니다).

4) 컬럼에 resin+protein을 넣고 내려준 후 버퍼를 4ml 넣고 내려줬습니다.

5) 후에 imidazole 10mM 6mL, 100mM 1mL, 500mM 1mL를 넣고 내려주었습니다. 

6) 100mM, 500mM 에서 나온 용액들을 모아 센트리콘에서 농축시켰습니다.

(cell을 너무 오래깨서 그런 걸까요??.....)

(정제 과정에서 사용된 버퍼들은 모두 차갑게 유지된 것들을 사용하였고, 얻은 단백질들은 얼음 속에 항상 보관했습니다.)

4. 전환률 50%의 단백질과 8%의 단백질의 정제도는 동일한 %를 가지고

비교한건가요?

그건 잘모르겠습니다...같이 실험을 진행하는 선배가 전에 실험 결과에서 50%정도가 전환이 되었다....고 하셨고 뒤의 8%의 경우에는 제가 이번에 100ml를 정제한 양으로 실험한 결과를 HPLC area 값을 가지고 임의로 계산을 진행해보았습니다.

 

 

대왕개구리SPEED  |  07.08 22:08  
정제도를 모르면 활성의 직접비교가 힘듭니다.
올챙이힘들다석사  |  07.08 22:10  

ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ그렇군요...그냥

선배께서는 비슷한 양을 깨라고 하시고는....

HPLC 상의 결과에서 피크로만 얘기하시더라구요....

그 선배님도 전의 선배 결과에서 결과만 알지 정확한 것은 아마 모르실 것이라 생각됩니다...

 

대왕개구리SPEED  |  07.08 22:20  

동일 효소 단백질 간의 활성 비교는 정제도 즉 시료중 효소 단백질이 차지하는

%에 따라 달라지기 때문에 단순히 동일하게 실험했다고 해서 동일한 결과가

나온다는 보장이 없습니다.

두 시료의 purity를 알지 못하면 기질 전환%는 의미가 없습니다.

올챙이힘들다석사  |  07.08 22:37  
ㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜ그렇군요....
그럼 혹시 제가 정제한 저 방법에 문제는 없을까요?ㅜㅜㅜㅜ
대왕개구리SPEED  |  07.08 22:50  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

정제가 되었기 때문에 정제 방법에 문제가 있지는 않습니다.

정제에는 정제 조건이 최적화 되었는지 최적화 되지 않았는지 문제가 있을

뿐입니다.

현재 정제 조건이 최적 조건인지는 정제 단계 별 조건 및 단계 별 fraction의

전체 전기영동 사진이 있어야 판단 가능합니다.

 

올챙이힘들다석사  |  07.08 22:54  
친절한 답변 감사합니다!!
대왕개구리강시  |  07.09 10:39  

그 선배의 결과에서 기질의 전환율이 50% 정도가 나왔는데

제가 정제한 후에 실험을 재현해보니 전환율이 8% 밖에 나오지 않았습니다.....

 

효소의 활성이 낮아서 기질이 산물로 전환되는 효율이 저하됬다는 의미죠?

이럴때는 정제된 단백질 몇 mg 을 (선배와 같은 조건에서 실험했을때) 사용해서 선배가 사용했던 기질농도의 실험에서 어떤 방법(가령 photometric 한 방법인지..... 등등) 전환율이 몇%라고 설명해 주시면 좋겠네요.

단백질 정제가 잘되서 선배와 같은 정도(가령 두 분 다 95% 정제)가 되었고,

실험에 사용하는 buffer나 온도, pH 등의 조건이 같고 반응 부피가 같고, 사용한 단백질의 양이 같고, 기질의 농도가 같을때의 값을 비교해 보세요.

 

많이 간과하지만 buffer가 다르거나(pH가 같아도),

기질의 농도가 다르거나,

단백질의 양(또는 농도) 이 다르거나,

효소반응 측정법이 다르거나 하면 결과값이 크게 다르게 나올 수도 있습니다.

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