효소의 최적 조건에 pH도 있지만 buffer염의 농도도 있습니다.
최종 몇 mM 버퍼를 사용할지를 정해서 한번에 해당 mM로 투석하면 됩니다.
효소액의 10배 ~20배 부피로 3회 정도 투석하면 됩니다.
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(대학원생)
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20.07.06 14:19
SPEED님 항상 감사드립니다.
혹시 최적 염 농도는 어디서 찾을 수 있을까요?ㅠㅠ
제가 실험할때는 주로 20 mM 버퍼를 사용하는데 ... 그 농도로 투석 진행하면 괜찮을까요?
제가 기초 지식이 너무 부족해서 ㅠ 너무 쉬운 질문이면 죄송합니다..
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(대학원생)
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20.07.06 14:32
dextransucrase 입니다!
assay buffer는 20mM Na-acetate buffer, pH5.4입니다.
이런 경우 pH7.0~7.5로 보관하고 assay시에만 20mM Na-acetate buffer, pH5.4를
사용하는 것이 좋습니다.
효소 보관은 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 보관하되 최적 활성 pH를
피하는 것이 효소 활성 유지에 좋습니다.
최적 조건을 맞추어 보관하면 항상 활성화 상태를 유지하기 때문에
효소 분자에 좋지 않습니다.
최적 온도가 37도인 효소를 37도에 보관하지 않는 것과 같은 원리입니다.
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(대학원생)
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20.07.06 14:50
그러면 20mM Na-acetate buffer, pH 7 의 버퍼로 dialysis 진행 후 보관하면 괜찮을까요??
갑작스럽게 염 농도를 낮추면 aggregation 될 수도 있다는 말을 봐서.. 단계적으로 투석을 진행해야 하는지 고민하고 있었습니다 ㅠ
- 20mM Na-acetate buffer, pH 7 의 버퍼로 dialysis 진행 후 보관하면 괜찮을까요??
: Na-acetate buffer로는 pH7을 만들수 없습니다.
buffer range에 벗어납니다.
- 갑작스럽게 염 농도를 낮추면 aggregation 될 수도 있다는 말을 봐서..
: 이런 경우는 insoluble 단백질을 soluble로 만들 경우 단계적 투석을 해야하고
soluble한 단백질의 경우 one step으로 해도 무방합니다.
불안하면 2 step 정도로 투석하면 됩니다.
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(대학원생)
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20.07.06 15:48
앗.. 그러면 정제시 사용했던 20 mM sodium phosphate(pH 7)로 투석 진행 후 효소 반응 시 20 mM sodium acetate를 사용하면 되는거 맞을까요?!
스피드님 친절하게 가르쳐주셔서 정말 감사합니다!
반응 buffer의 working 농도가 20mM이면 100mM 정도로 만들어 반응 부피의
1/5 넣으면 됩니다.
20mM Na-acetate buffer를 만들어 놓으면 반응에 사용하기 힘듭니다.
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(대학원생)
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20.07.08 00:14
스피드님! 진행하다보니 궁금한게 더 생겨서 질문 드립니다!!
제가 enzyme activity 측정할 때는 20 mM Na-Ac buffer (pH 5.2) 사용하는데
효소의 온도 안정성이나 최적 온도 특성 연구를 진행할 때는 20 mM로 사용하면 정확히 pH가 5.2가 안 되지 않을까요..? (보관하는 enzyme pH가 7.0 이라서요...)
그 전에는 원균주로 사용을 했었는데 유산균이라서 암모니아 워터를 같이 넣어서 pH를 맞춰주었었습니다.
재조합은 처음이라.. 20 mM 정도만 넣어줘도 괜찮을까요?
아니면 50 mM 정도로 높여주어야 할까요? 그런데 activity assay할때 농도와 특성 연구할때 버퍼 농도가 달라도 괜찮나요? 다른 논문들을 찾아보니 다 똑같아서요!!
질문이 너무 많아 죄송합니다 ㅠㅠ.. 답변해주시면 정말 큰 도움이 될 것 같습니다 스피드님!!
- 재조합은 처음이라.. 20 mM 정도만 넣어줘도 괜찮을까요?
: 효소 측정은 재조합 하고는 상관 없습니다.
위 답변에 설명했듯이 20mM을 바로 사용하면 안되고 stock 농도를 사용해서
activity를 측정해야 합니다.