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pET system에서 단백질 발현하는 방법은 연구자에 따라 여러가지 방법을
사용합니다.
단백질 양을 최대한 많이 얻으려면 전배양 없이 하루에 발현하는 방법을
사용하는 것이 좋습니다.
전배양을 몇시간 정도 할 예정인가요?
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레벨5
힘들다힘들어
(대학원생)
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20.07.03 12:24
SPEED 님, PRSET A 벡터를 이용해서 하고있습니다.
전배양을 9시반 가량에 시작했는데 10시에 분명히 뿌옇게 올라오는걸 확인했는데 11시좀 넘어서 확인하니까 투명해져있는걸 확인했습니다ㅠ 1시간반 가량 사이에 벌어진 일입니다..ㅠㅠ
평소에는 저희가 전배양을 약 2-3시간정도 하고 있습니다.
phage 문제는 아닌것 같습니다.
혹시 단백질이 박테리아 성장에 독성이 있나요?
host cell만 CM 넣고 배양을 해보세요.
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레벨5
힘들다힘들어
(대학원생)
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20.07.03 13:22
LB 에 그냥 균만 넣고 키워보라는 말씀이시죠?
그리고 toxic 한지는 모르겠지만 그럴 수도 있을거 같습니다.
full 서열에서 N term 일부가 잘린 단백질인데요, 일부가 잘리면서 세포에서 cytokine 을 방출하게 되거든요...
근데 학위과정 들어오고 수년간 해당 단백질 expression을 했었는데 지금껏 아무문제가 없었는데...ㅠㅠㅠ 갑자기 이럴 수도 있나요ㅠㅠ
네. host cell에 pLysS가 들어 있으니 CM만 넣고 LB에 배양해 보세요.
phage 오염같으면 host 만 배양해도 유사한 증상이 있을 것으로 예상됩니다.
현재 단백질이 발현이 잘되다가 갑자기 이런 현상이 일어났나요 아니면
처음 발현하는 건가요?
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레벨5
힘들다힘들어
(대학원생)
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20.07.03 14:12
4-5년째 멀쩡히 발현하던 단백질입니다ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ처음해보는 단백질은 아닙니다ㅠ
예전에 발현하던 vector, host cell이 현재와 동일한가요?
바뀐건 없나요?
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레벨5
힘들다힘들어
(대학원생)
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20.07.03 20:13
네 다 동일하고 6월 중순 들어서 계속 실패하고 있습니다ㅠㅠㅠ
시약이 오염된걸까요...?
파지 오염이 의심됩니다.
플라스크 및 인큐베이터 등등 아주 각잡고 청소해야 합니다.
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레벨1
상어는 야옹
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22.10.19 22:58
비슷한 경험을 하고 있습니다 …
혹시 이 문제를 어떻게 해결하셨을까요 ..?
pRSETa vector이고 strain은 BL21(DE3) 입니다 ㅠ
도와주세요 …
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레벨5
아이고야
(대학원생)
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22.11.13 23:45
앞의 질문에도 달아주셨지만, 전 결과론적으로 파지 오염이라 락스로 싹 청소하고 플라스크 새로 다 바꾸고 난리쳐서 잡았습니다! 이 답변을 보시면 좋겠네요ㅠㅠ