[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
실험 테크니션 설문결과
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 663  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 E coli 가 자꾸 죽고 있어요...도와주세요..ㅠㅠ
개구리힘들다힘들어(대학원생)  | 07.03 12:07

안녕하세요ㅠ

BL21(DE3)PLySs 를 이용해서 protein expression을 계속 하고 있는데요...늘 계써오던 것이 문제를 일으켰습니다..ㅠㅠ

이 전 글에도 작성했지만, 전배양중이던 대장균이 OD 가 올라가는듯 하더니 어느순간 degradation 되서 짧게 끊어진 실같은게 둥둥 떠다닙니다ㅠ

Amp, Chl 모두 fresh 하게 만들었구...TF를 하거나 기존에 만들어둔 stock 을 써도 자꾸 죽습니다ㅠ 

(Amp final concentration 100ug/ml, Chlroramphenicol final concentration 34ug/ml)

plate 에서는 멀쩡히 뜨는데 전배양만 가면 죽어요ㅠㅠㅠㅠ

phage contamination이라고 언급해주신 분들을 봐서 새 플라스크도 구매했는데요...전배양은 저희가 코니컬 튜브(멸균된제품)에서 진행 후 플라스크로 가고 있는데 전배양 단계에서 죽고 있는거라 ㅠㅠㅠ

어떤 부분을 의심해봐야할지 조언 좀 부탁드리겠습니다ㅠㅠ

 

#E coli
 
#protein
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.03 12:19  

pET system에서 단백질 발현하는 방법은 연구자에 따라 여러가지 방법을

사용합니다.

단백질 양을 최대한 많이 얻으려면 전배양 없이 하루에 발현하는 방법을

사용하는 것이 좋습니다.

전배양을 몇시간 정도 할 예정인가요?

 

개구리힘들다힘들어  |  07.03 12:24  

SPEED 님, PRSET A 벡터를 이용해서 하고있습니다.

전배양을 9시반 가량에 시작했는데 10시에 분명히 뿌옇게 올라오는걸 확인했는데 11시좀 넘어서 확인하니까 투명해져있는걸 확인했습니다ㅠ 1시간반 가량 사이에 벌어진 일입니다..ㅠㅠ

평소에는 저희가 전배양을 약 2-3시간정도 하고 있습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  07.03 12:35  

phage 문제는 아닌것 같습니다.

혹시 단백질이 박테리아 성장에 독성이 있나요?

host cell만 CM 넣고 배양을 해보세요.

개구리힘들다힘들어  |  07.03 13:22  

LB 에 그냥 균만 넣고 키워보라는 말씀이시죠?

그리고 toxic 한지는 모르겠지만 그럴 수도 있을거 같습니다.

full 서열에서 N term 일부가 잘린 단백질인데요, 일부가 잘리면서 세포에서 cytokine 을 방출하게 되거든요...

근데 학위과정 들어오고 수년간 해당 단백질 expression을 했었는데 지금껏 아무문제가 없었는데...ㅠㅠㅠ 갑자기 이럴 수도 있나요ㅠㅠ 

대왕개구리SPEED  |  07.03 13:30  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네. host cell에 pLysS가 들어 있으니 CM만 넣고 LB에 배양해 보세요.

phage 오염같으면 host 만 배양해도 유사한 증상이 있을 것으로 예상됩니다.

 

현재 단백질이 발현이 잘되다가 갑자기 이런 현상이 일어났나요 아니면

처음 발현하는 건가요?

개구리힘들다힘들어  |  07.03 14:12  

4-5년째 멀쩡히 발현하던 단백질입니다ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ처음해보는 단백질은 아닙니다ㅠ 

대왕개구리SPEED  |  07.03 14:37  

예전에 발현하던 vector, host cell이 현재와 동일한가요?

바뀐건 없나요?

개구리힘들다힘들어  |  07.03 20:13  

네 다 동일하고 6월 중순 들어서 계속 실패하고 있습니다ㅠㅠㅠ

시약이 오염된걸까요...?

;;  |  07.08 11:44   

파지 오염이 의심됩니다. 
플라스크 및 인큐베이터 등등 아주 각잡고 청소해야 합니다. 

답변하기
할인행사 광고 검색광고
바이오디 바이오디
Wet 방식의 장점에 속도와 편리함까지 지닌 eBlot & eStain 파격 할인 (8.31까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 할인 행사 (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
nanoString & COVID-19 / 다양한 Cloning application에 적용 가능한 com... (8.27까지)
케이비티 케이비티
[KBT] Thermo Shaker, Sonicator, Mixer, Heating Block, Rotato.. (8.16까지)
브래디 브래디
초저온라벨 등 실험실용 풀칼라프린터 (COVID-19 안전사인 지원) (8.30까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN] Reading과 형광 Imaging을 하나의 장비로 한 번에!! [Multi-mode micr.. (8.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
qPCR/PCR 셋업을 자동분주기로 개선해보세요. : epMotion5070PCR (8.8까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
6/6  좌우
47,20044,900
52,60050,000
49,000
739,000702,100
92,30087,700
773,000734,400
109,000
493,000
482,000
482,000
370,000
339,400322,500
17,000
130,500124,000
143,800136,700
125,500119,300
139,000132,100
136,000129,200
468,000
66,50063,200
6,000
79,50075,600
23,000
93,20088,600
최근등록   더보기 >
cell dilution 관련 질문 있습니다.   08.06
단클론항체로 면역혈청을 만드는 과정에 대한 효율적인 알고리즘을 생각해봤습니다. 실현 가능성...   08.06
mRNA gene expression 결과 해석 (멜팅커브는 잘 그려졌는데 결과가 이상할때...   08.06
Copy 계산   08.06
두 시약이 같은 시약인지가 궁금합니다   08.06
세균 Phylum별 최적배지를 알려주세요.   08.06
real time pcr 동일 조건이 중요한 이유   08.06
pET 벡터 사용 - tag필요하지 않을 경우   08.06
human melanoma cell line 분양해주실 분 없나용 ㅠㅠ   08.06
Collagenase type 2 사용 시에 Cacl2를 첨가해주시나요?   08.06
(주)비아이코퍼레이션
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크