실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Sequencing
같은 template로 PCR을 진행하는데 sequencing 결과가 다르게 나타납니다.
레벨1 움굼 (대학원생)
안녕하세요 PCR 실험을 진행하고 있는 대학원생입니다.
제가 최근에 PCR을 진행하면서 해석하기 어려운 결과가 나타나서 질문을 드립니다.
Template는 animal whole blood에서 extraction하여 획득했습니다.
같은 template에서 같은 유전자를 target으로 PCR을 진행한 후 전기영동을 하고 gel을 elution 하여 sequencing을 진행했습니다.
이 실험에서 sample은 두 가지입니다.
1. 일반적인 Taq polymerase를 사용 (ST116-500)
2. Hot start 전용 Taq polymerase를 사용 (HS106-250)
두 sample의 실험조건은 상이하며 (해당 Taq polymerase kit의 protocol을 따랐습니다) 같은 template를 사용했습니다.
primer는 상이하긴 하지만 1~2bp만 차이가 납니다. (서열은 아래와 같습니다.)
(A[AGCTGAGCCCTTTCCCCTT)C]
[(CAGAGAGGCAGGTGCCCT)GT]
() 내의 서열은 Hot start polymerase를 이용해 실험할 때 사용한 primer이며
[] 내의 서열은 일반 Taq polymerase를 이용해 실험할 때 사용한 primer입니다.
전기영동을 통해 band를 보고 target 유전자가 제대로 증폭이 되는 것도 확인이 됩니다.
하지만 sequencing 결과가 두 sample에서 차이가 납니다.
본 사진의 두 sequence는 alignment 진행한 결과 중 다른 부분만 따온 것입니다. 위 sequence는 Hot start Taq polymerase를 사용한 결과이고, 아래는 일반적인 Taq polymerase를 사용한 결과입니다. 본 사진에서 모든 sequence를 보여드리지 않은 이유는 나머지는 모두 일치하기 때문입니다.
위 사진에서 보여지듯이 같은 template를 사용한 결과임에도 sequencing 결과가 다르게 나타납니다. 본 실험은 재 실험을 진행하더라도 같은 결과가 나타났습니다.
같은 template를 사용하여 같은 유전자를 target으로 PCR을 진행하더라도 실험조건이나 Taq polymerase, primer등이 다르다면 sequencing 결과가 다르게 나타날 수 있을까요?
원인을 알 수 없어 답답합니다. 조언 부탁드리겠습니다.
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