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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 RNA isolation 실험준비중 질문이 있습니다.
올챙이dmgk(대학생)  | 07.02 19:03
안녕하세요
연구실에서 공부하고 있는 초보학부실험생입니다.
RNA isolation실험을 하기 위해 여러 이론공부를 하던 중 궁금한점이 생겼습니다.
저희실험실에 사용하는 kit에는 산성인 페놀이 존재하는데요

1.
자료를 찾아본결과 어떤곳에서는 페놀이 산성인 이유로 인해 크기가 큰 DNA는 변성되나 크기가 상대적으로 작은 RNA는 파괴되지 않는다고 하였고
어떤곳에서는 단백질,DNA,RNA 모든것이 산에서 변성된다고 합니다.
저의 생각에는 단백질,DNA,RNA가 모두 변성되나 RNA의 변성이 좀 덜하다고 생각하는데 맞나요?

2.
여러자료를 찾아보았지만 클로로폼 처리하고 3개의 층이 분리되었을 때
맨 위층에 RNA가 있다는 것은 이해가되지만 나머지 아래 두층에 관해서는 여러말이 있어 많이 혼란이 옵니다.

어떤곳에서는 맨 밑에층에 ripid, protein , 중간층에 choloform과 변성된 DNA가 위치한다고 하는데
다른곳에서는 변성된 DNA는 맨밑 유기용매층으로 가고 단백질은 변성이되어도 유기용매에 녹지않아 중간층에 모이게 되고 맨위 수층에는 RNA가 남게된다고 합니다.
또 선배한테 배우기로는 3개 층을 볼때 맨아래층이 chloroform층, 그리고 중간층에 있는것은 변성된 단백질과 DNA 층이라고 들었습니다.
정확히 맨밑에층과 가운데층은 무엇이 위치하는걸까요?


실험하는데 필요없는 질문들이기는 하나
초보실험자라 이론을 충분히 공부하고 확인을 받아야 하는 입장이기도 하고 너무 궁금해서 질문올립니다.
답변 부탁드려요

#RNA isolation
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.02 19:24  

1. 산성 페놀을 사용할 때

- 단백질 : pH 관계 없이 페놀에 의하여 변성 및 원심분리 후 중간층에 위치

- RNA : 수용액층에 존재

- DNA : 인산기 pKa로 인해 대부분 페놀층으로 이동 및 미량 중간층에 위치.

산성페놀로 RNA 추출할 때 세포와 산성 페놀을 혼합한후 강하게 30초 정도

교반합니다.

강하게 교반 할수록 RNA가 깨끗하게 분리됩니다.

이때 DNA가 분해 되지만 산성이 아니면 변성되지 않고 수용액으로 이동하기

때문에 산성 pH를 사용하여 수용액에 녹지 않게 해서 유기용매인 페놀층으로

DNA를 이동시킵니다.

2. 클로로포름을 언제 처리한다는 것인가요?

DNA, RNA가 있는 용액을 클로포름만 처리하면 모두 수용액층에 있습니다.

개구리금상품권  |  07.02 21:48  

1.
자료를 찾아본결과 어떤곳에서는 페놀이 산성인 이유로 인해 크기가 큰 DNA는 변성되나 크기가 상대적으로 작은 RNA는 파괴되지 않는다고 하였고
어떤곳에서는 단백질,DNA,RNA 모든것이 산에서 변성된다고 합니다.
저의 생각에는 단백질,DNA,RNA가 모두 변성되나 RNA의 변성이 좀 덜하다고 생각하는데 맞나요?

 : 거의 대부분의 DNA는 이중나선으로 구조를 이루고 있고, 변성... 구조적으로 망가짐이 생겨서 불수용성이 될 확률이 RNA 보다 높습니다. 상대적으로 크기가 작은 RNA가 다시 refold 되는 확률도 높죠. 

보다 작은 protein은 3차, 4차 구조를 이루는데, 오히려 RNA나 DNA 보다 refold의 수율이 낮습니다. 다시 3, 4차의 구조로 돌아오기 쉽지 않은 경우가 많습니다. (단백질의 구조는 ER, goli 등등의 소기관, chaperone 등이 구조형성을 도와줘서..)

 


2.
여러자료를 찾아보았지만 클로로폼 처리하고 3개의 층이 분리되었을 때
맨 위층에 RNA가 있다는 것은 이해가되지만 나머지 아래 두층에 관해서는 여러말이 있어 많이 혼란이 옵니다.

: SPEED 님 말씀처럼 위치합니다. 

  다만 100%가 아니기 때문에 많은 이야기가 있는 것이지만, 

 SPEED 님의 답변처럼 위치 됩니다. 

  

 

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