실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
western blot actin이 일정하지 않아요
레벨1 날으는돼토 (대학원생)
액틴이 잘 안잡힙니다.
설명드리자면 mouse kidney 샘플이구요, 현재 실험실에서 같은 샘플,같은 세팅으로 저만 액틴이 들쑥날쑥한 상황입니다.
처음에는 정량 문제인줄알고 수도 없이 정량을 반복햇습니다. standard curve 는 항상0.998~0.999를 유지하고 있습니다. 저희 박사님이랑 비교를 해봐도 그렇게 많은 차이를 보이고 있지도 않구요.
transfer 도 같은 장치 같은 세팅으로 진행하였습니다.정작 매번 transfer 하고 나서 폰슈로 확인을하면 actin 위치에 보이는 밴드는 엄청 깔끔하게 같은 모양을 하고 있어요.
actin 은 1;10000으로 4도 O/N하고 2차는 1:5000으로 2h 붙힘니다. 뭐 이건 몇년간 실험실에서 항상 해오던거라서 의심조차 안하고 있습니다.
지금 첨부한 파일에서 오른쪽 위에건 나름 잘 나온 경우인데 정작 타겟이랑 같이 보려고 하면 폭망입니다. 대부분 경우 3번째 줄 밴드만 빵빵하게 뜨고 나머지 위에두 밴드 혹은 그 아래 밴드들은 심한경우 거의 안보일 정도로 나오고 그래요.
문제는 제가하면 자주 망하고 다른 분들이 하시면 그렇지 않다는 겁니다.저도 항시 그런것도 아니고 어떤때는 잘 나오다가 또 어떤때는 참... 다른 분들도 이런경우는 처음봐서 trouble shooting 이 안돼요.
갈피를 잡을수 없네요.
어디에 문제가 생겻을 가능성이 큰지 가르쳐 주세요. 제발요....ㅠㅠ
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