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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 기본적인 SDS PAGE 관련하며 질문드립니다.
개구리시은(대학원생)  | 2020.06.30 18:28

현재 SDS PAGE를 진행하고 있는 석사생입니다.

 

고수님들의 의견을 여쭙고 싶어 이렇게 글을 쓰게 되었습니다.

이전에 PAGE를 내일 떄 큰문제가 없었는데 어느날 부터 10개 lane중에 9개lane에 maker제외 동일한 양을 넣고 로딩을 했을때 찌그러 지는 듯한 양상이 관찰되어 사용하던 solution이나 buffer들을 다 교체하고 다시 내렸을때는 또 괜찮아 지는 듯 해서 그대로 사용을 했었는데 최근데 조금씩 찌그러 지는 양상이 관찰되어 질문드리게 되었습니다.

 

1. 10개의 lane중에 5개만 내린다고 한다면 다른 빈 lane에는동일양 양의 sample buffer를 넣어주어야 하나요?

2. 그리고 각 lane당에 로딩양이 거의 비슷하게 로딩하는것이 정석인가요? 

만약에 5개 lane중에 maker제외하고 4개 lane에  5 12 20 28ul을 로딩한다고 하면 찌그러지는게 일발적인가요..? 이렇게 로딩을 해 봤을때 찌그러지는 경우도 있어고 아닌경우도 있어서 제 스스로 확답을 내리기가 힘이드네요

파워 서플라이나 접촉단자등을 확인해 봤을때는 기기자체의 문제는 아닌것같은데 

기본적인 SDSPAGE에서 문제가 계속 발생해서 답답합니다. 

보통 SDS PAGE 찌그러 지시는 경우에는 어떠한 순서로 troble shooting하시는지 궁금합니다.

 

감사합니다.

 

 

#SDSPAGE
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.06.30   

찌그러지는 형태도 여러가지 입니다.

어떤 형태인지 감이 안잡히네요.

well은 필요한 갯수만 loading해도 되고 단백질 양이 각각 달라도 됩니다.

gel을 직접 만들었다면 buffer문제, 균일하게 굳지않은 문제, electrode문제 등

여러가지 원인이 있을 겁니다.

대왕개구리강시  |  2020.06.30   

SDS-PAGE의 초기 전개에는 시료의 salt 농도가 단백질 이동속도에 영향을 줍니다. 모든 lane에 같은 농도의 salt 를 가지는 단백질을 로딩하면 각 lane의 밴드들이 깨끗하게 전개됩니다.

그래서 모든 lane에 같은 salt농도의 시료를 다 로딩하거나, 빈 well에 sample buffer를 넣어주는게 좋습니다.

단백질 시료에 들어간 sample buffer가 5ul라면 빈 well에도 saple buffer 5ul를 넣어주면 좋습니다.

각 well에 로딩양이 달라도 상관은 없으나 각 시료에 섞어준 saple buffer의 양은 맞춰주는게 좋습니다.

5개 lane중에 maker제외하고 4개 lane에  5 12 20 28ul을 로딩한다고 하면, 가장 양이 많은것이 28ul이므로, 저 같으면 나머지 시료들도 1X sample buffer를 23ul, 16ul, 8ul 를 넣어서 최종 부피를 같게 맞춰줍니다. 나머지 well에도 같은 양의 sample buffer를 넣어주고요. 그러면 로딩양도 같고 sample buffer의 양도 같아지므로 아무래도 각 lane의 밴드들이 비슷하게 흐르겠죠.

개구리시은  |  2020.06.30   

이전에도 SPEED님께서 답변을 주셨던 내용입니다ㅠㅠ

 

상단부분은 더 내려오고 하단 부분은 덜 내려오는 듯한 모습도 관찰되며

2번 10번 레인에서 옆으로 길죽하게 퍼지는? 늘어지는 현상도 관찮이 됩니다. 

 

여기서 제일 의문인것은 같은 제작용액 같은 기기 같은 buffer를 사용하고 / 동일한 사람또는 다른 사람이 실험하는 경우에 제대로 내려올 때도, 찌그러 질때도 있습니다. 

혹시 buffer가 세는게 많으면 심하게 찌그러 지는 경우가 생길까요? 확인은 하고 있습니다만...

 

대왕개구리SPEED  |  2020.06.30   

예전에 gel을 본 기억이 납니다.

아직 해결이 안되었나 보네요.

buffer가 세면 그 부분을 중심으로 잘 안내려가서 휘어지는 현상이 나오기는

합니다만..

미세하게나마 buffer가 세면 정상적으로 내려갈 때 보다 V나 mA값에 변동이

생기니 확인해 보세요.

전기영동 시작전 upper buffer의 높이를 눈금으로 그어서 변화가 있는지도

확인해 보세요.

개구리시은  |  2020.07.01   

버퍼 세는것도 확인하고 있고 용액모두 새것으로 바꾸었습니다. 

 

기존에는 V기준으로 내리고있었습니다만 요즘 이전에 사용하던 V로는 디텍션이 안되어서 A기준으로 내리고 있습니다.

 

초기에 Gel 2개기준 0.02A로 설정하면 50V정도에서 시간이 지나면서 V가 70-80까지 오르더라구요 이후 stacking 지나면 0.04A로 설정하며 내리고있습니다. 이 때 V는 180V정도 입니다.

 

보통 내리시는 V나 A의 기준이나 전체적인 gel내리는 시간은 어느정도가 적당한가요..? 

너무 기본적인 질문들이라 여쭙기 죄송하네요.. 찾아보고 있으나 확 와닿는 결론이 없네요 ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  2020.07.01   

SDS-PAGE 전기영동에서 V를 고정하거나 A를 고정하거나 아무런 문제는

없습니다.

얼마 정도의 power로 해야된다는 기준 또한 없습니다.

전기영동에 문제만 없으면 아무런 관계가 없습니다.

저의 경우 upper gel은 80V, lower gel은 150 ~ 180V 사이에서 항상 합니다.

이것 또한 하나의 예로 다르게 해도 전기영동이 잘되면 아무런 문제가 없습니다.

gel은 현재 사용하는 걸로 만들고 전기영동 장치는 다른 lab에 있는 걸로 한번

해보세요.

개구리시은  |  2020.07.02   

어제 다시 gel을 내려 보았을 때는 또 이상 없이 정상적으로 잘 내려왔네요 

기기자체 결함일수도 있겠다는 생각이 듭니다. 

 

도움이 많이 되었습니다. 감사합니다. speed님 강시님

 

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