우선 꼬리에서 추출한 gDNA는 전기영동 해봤나요?
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 17:34
네. DNA 샘플양을 12ul 늘렸지만 희미하게 나오네요.
아예 안 나온 것 보다 낫지만..ㅜㅜ
primer는 어떤 걸 사용하나요?
앞 질문에서 mixture를 보니 buffer에 따로 Mg를 넣어 주던데 buffer에 안들어
있나요?
그리고 mixture를 따로 혼합하지 말고 만들어 놓은 걸 사용해 보세요.
전기영동 gel을 보니 primer 농도도 잘못된것 같습니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 18:01
프라이머는 Sarm1 (삼원) 이라는 프라이머를 0.1X 여유분 갯수에 맞춰 사용하고 있습니다. 총 3개 들어 갑니다.
마그네슘은 따로 없고 포함되어 있습니다.
농도는 잘 못 된 것이 없습니다.
믹스쳐는 1.5ml 튜브에 혼합해서 씁니다. 따로 쓰라는 것이 PCR 튜브에 각각 따로 넣으라는 말인가요? 이렇게 해본 적 없어요. 번거 롭구요.
경험이 별로 없는것으로 보이는데 전기영동 결과보면 primer 잘못들어간게
확실합니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 20:46
프라이머가 잘못 들어간 것은 아닙니다.
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primer
(비회원)
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20.06.30 01:46
primer의 염기서열에는 문제가 없더라도, 그 프라이머를 다루는 방식이나 프라이머의 보관 상태에 문제가 있을 가능성이 있습니다. 너무 자신있게 프라이머는 괜찮다고 하시는 거 같은데, 한번 점검해 보실 필요는 있습니다. 멀쩡하게 몇년 쓰다가도 훅가는게 프라이머입니다.
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asdf
(비회원)
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20.06.30 02:02
1. gel에 ladder는 잘 보이나요? 겔은 잘 만들어졌고, 다른 pcr 반응에서 밴드는 잘 보이나요?
2. 일단 gDNA 추출 step에 문제가 없는지 보려면 gDNA를 증폭하지 말고 그대로 걸어보십시오. 젤 가장 위에 깔끔한 밴드가 뜨면 성공입니다.
https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=605538 그림의 노란박스 쳐진 것 처럼 나와야 합니다.
3. gDNA가 잘 추출되었을 경우 pcr reaction의 이상은 pcr 조건의 문제이거나 primer의 문제일 가능성이 높을겁니다. (키트의 시약 상태가 엉망이 아니라면요)
-해당 pcr 조건 (melting temp 등) 상에서 이미 확인한 결과가 있었나요? (직접)
-primer는 과거에 잘 작용하는지 확인한 결과가 있었나요? (직접)
없다면 실험실에서 잘 돌아가는 조건을 잡아야 할 것으로 보입니다. 과거 성공한 적이 있다면 pcr 조건이 괜찮다는 것이므로 primer 상태의 변성 등의 문제를 고려해야 할 것입니다.
예전에 마우스 꼬리에서 Phenol extraction로 gDNA 뽑은 protocol 입니다.
1. Place mouse tails in 500uL tail digestion buffer
a. Tail digestion buffer (1L):
- 100 mL 1M Tris (pH 8.5)
- 10 mL 0.5M EDTA
- 20 mL 10% SDS
- 40 mL 5mM NaCl
- D.W. up to 1L
2. Add 2.5 uL Proteinase K (from 10 mg/mL stock)
3. Vortex and incubate at 55℃ overnight (Lysis 과정입니다. Optimize 가능)
4. Add 500 uL Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (Use lower layer part)
5. Vortex and spin at 14000 rpm for 10 min.
6. Remove upper aqueous phase into new 1.5 mL tube.
7. Add 500 uL Isopropanol
8. Vortex and spin at 14000 rpm for 10 min.
9. Decant supernatant and wash pellet with 500 uL 70% EtOH
10. Vortex and spin at 14000 rpm for 10 min.
11. Decant supernatant, blot tube on paper towel and leave inverted to dry at RT for 15 min (잘 마를 때 까지 하면 됩니다.)
12. Resuspend in 50 uL TE buffer (더 진하게 하려면 더 적은 buffer로 resuspend)
13. Incubate to fully dissolve at 37℃ for at least 30 min.
14. Check the purity and concentration by nanodrop
55 C overnight이 잘될 것 같지만,
가장 적절한 인큐베이션은 2-2.5 h (at 55 C) 입니다 (Qiagen DNA kit).
근거: 쥐 350 마리, 렛 499 마리의 지노믹 디엔에이로 지노타이핑 해보았어요.
1시간도 해보고, 2-2.5시간도 해보고, 오버나잇도 해보고요 (특히 하루에 다못 끝낼 때, 넘겨놓고 그 다음날 하려고...)
시간, 리에이젼트를 가장 효율적으로 쓸 수 있는 방법은, 지노타이핑의 경우,
샘플이 마련되는데로 올더웨이로 쭉 하되, 특히 55도 부분은 2-2.5 시간에 끝낸다. 너무 과해도 너무 모자라도 좋지 않음.
지노타이핑...처음에 어렵습니다. 그러나, 어느 순간 터득되는 시점이 올 것입니다. 그러면, 그냥 던져도, 다 됩니다. 게다가
크라이오 색션으로 히스탈라지 하려고 글래스 슬라이드에 붙어 있는 조직 띄어다다 지노타이핑 해도 (적은 양임) 자알 됩니다.
그렇게 잘 되기까지, 시간이 걸립니다 (경험이 쌓여야 함). 잘 버티세요!
all the way through 하려면,
샘플을 -20도나 -80도에 모아 두었다가,
10-12개가 채워지면 한번에 모아서 하면, 효율적입니다.
처음엔 4-6개로 배치를 짜서, 6개 모일 때 마다 한번씩 하세요.
시작하면 끝을 보는 게 좋음. 오버나잇 하지 마세요 (지노타이핑은).
차라리 냉동실에 넣어두었다가, 그 다음날 시작-끝 내는 것이 더 좋은 결과얻음.