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많은 것을 체크해야갰군요.
PCR kit는 유효한가? 이건 positive control을 해야 해결됩니다.
template는 온전한가? template를 젤을 걸어서 확인해야죠.
primer는 온전한가? primer가 template에 잘 붙도록 디자인 되었는지 확인해야 합니다.
annealing temp는 맞는가? 두 primer의 Tm 이 비슷한지 확인해야 하며, gradient PCR을 해 봐야 합니다.
결국 control이 없어서 아무런 해답을 줄 수 없는 상황입니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 13:22
마커도 4ul 당연히 넣었지요.
DNA 양도 늘려서 다시 하고 있어요.
윗쪽 젤의 맨 왼쪽이 마커인가요?
마커가 안보이고 젤이 엄청 찐하게 염색된것 같군요.
destaining을 해 보세요.
staining이 너무 진해서 밴드가 안보일 수 있습니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 13:55
34개 샘플 기준(36개)
* DDW-187.2 (2ul,2ul,0.5ul,0.1,01,0.1+DNA 10ul) 총 14.8
(20-14.8= 5.2X 36=) 187.2
* 10X mg2+ buffer 2X 36=72
* dNTP 2X 36=72
* N-Taq-Hot 0.5 X 36= 18
* 프라이머 0.1 X 36=3.6 (총 3개)
믹스쳐 생산 후 볼텍싱
-12ul 샘플 분주(보통 2ul~10ul) 너무 안나와서.
-믹스 10ul 각 각 DNA 튜브에 분주
- PCR 진행 약 1시간 30분
PCR 끝나면, 순서대로 6X 다이 4ul 분주 후
2% 아가로즈겔에 차례대로 로딩 135V 40분
진행 끝나면 Etbr 20분 ~40분 스테인
막상 확인하면 마커와 밴드가 실종 상태 반복.
마커와 밴드가 실종이라구요?
그러면 PCR의 문제가 아닐 수 있네요.
우선 젤사진에 보이는 정도의 staining이 너무 과하므로 destaining을 해서 마커가 보이는지 확인해 보세요.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 16:26
강시님 관심 감사드립니다. 다시 실험을 진행하고 있습니다.
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레벨5
동물연구
(과기인)
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20.06.29 20:48
해결점이 없네요.다시 하는 수 밖에요.
Marker를 포함해서 전혀 흔적이 검출되지 않는걸 봐서는, PCR자체보다는 Visualizing과정의 문제인듯. EtBr이나 기타 Staining Reagent 문제와 <br />
UV Transilluminator 문제를 확인해보세요. 일단 PCR 하기전에 Ladder로 이 문제부터 해결하시는게 우선일듯.