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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 마우스 지노타이핑 PCR
개구리동물연구(과기인)  | 06.27 17:48

마우스 꼬리를 잘라서 지노타이핑을 하는데 

실패를 많이 하여 이런저런 시도를 해보다가 DNA양이

 적을 수도 있다는 생각이 들어서요.

트리스 버퍼를 100ul 넣고 마리당 1시간 정도  히팅 시키는데도

꼬리 색이 우려 나올 정도인데 안 나오는 경우가 허다 하네요.

DNA 양도 늘려 보는데 판독이 안 됩니다.

DNA를 정확하고 좀 더 진하게 얻어서 PCR을 한번만 하고 싶은데요.

어떤 방법이 있을까요?

DNA 추출 실험은 진행 하지 않음.

34개 기준으로 믹스는 +2 하여 36개 생성

DDW - (nTC-Hot-buffer 2ul+ nTaq-hot 0.5, dNTP 2ul

          프라이머1 0.1  프라이머 0.1, 프라이머 0.1

       DNA 5ul) 2+2+0.5+0.1+0.1+0.1+DNA 5ul=9.8

   PCR 총 볼륨 20ul-9.8 = 10.2X 36=367.2 (DDW)

 

nTC-Hot- Buffer 2X 36 =72ul

dNTP 2X 36=72ul

n-Taq-HOT 0.5 X 36=18ul

프라이머 1 0.1X 36=3.6 (총 3개)

 

믹스 생성 후 볼텍싱

 

PCR 튜브에 15ul씩 각각 34개 튜브에 분주

DNA 5ul씩 각 각 34개 분주

PCR 1시간 30분 정도 진행. 수정 불가. 정해진 코스

 

1시간 30분 후에 로딩 다이 4ul씩 각각 분주 후  피펫팅 후

2% 아가로즈 겔에 1X TAE에  135V 40분 동안 로딩

20분 동안 EtBr로 스테인

UV 판독

이런 순서 인데 UV로 비춰 보면 없는 경우가 많아요. ㅜㅜ

 

해결 방법 좀 알려주세요.

#DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리영빙구  |  06.29 09:04  

음 일단 실험에 대한 질문 먼저 할께요

1.트리스 버퍼 조성이 무엇인지? 
2. (중요)DNA purification 과정을 생략한 이유?

저의 경우에는 꼬리 잘라서 tube에 넣은 뒤 mouse tail lysis buffer 0.5 ml에 넣고 55도씨 650 rpm overnight으로 반응 진행하고
다음날 saturated NaCl 0.3 ml 처리해서 DNA purification진행 했어요

이러면 마지막에 DNA pellet나오니까 농도조절도 되고요 그 뒤로는 크게 문제될게 없어 보이네요

개구리동물연구  |  06.29 10:20  
버퍼A는 25ml naoh, 0.2M EDTA를 꼬리와 함께 100ul넣고 100도에서 히팅 시킨 후 얼음에 10분 방치후
버퍼b인 40mM tris hcl ph 5.5넣고 볼텍싱 1분 동안 하고 13.000rpm에서 10분 돌리고 바로 pcr 입니다.

따로 dna추출 실험하면 정확하니 좋겠지만 제 실험실에서는 하지 않고 있고 여러번 했는데 안 나오면 꼬리 자르는 것 부터 다시해요. 무슨 도박하듯이 하니 미치겠어요ㅜㅜ
개구리동물연구  |  06.29 11:25  
첨부파일 파일첨부: 20200629_111850~2.jpg (1,068 KB)
이미지 첨부파일
이렇게 나오는데요.. 아무것도 안 나와요..ㅜㅜ
쥐꼬리  |  06.30 17:40   

오히려 농도가 너무 높아서 PCR이 안될 수 있습니다.

꼬리 녹인 버퍼 1ul 따서 새 버퍼 또는 물 50-100 ul 넣고 희석한 후 희석한 1ul를 template로 써보세요.

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