loading dye 색인것 같은데 추출 수율하고는 관계없습니다.

추출 방법적인 문제 일 것 같습니다.

현재 사용하는 kit는 95% 이상 band 회수 가능합니다.

빠른 답변 정말 감사합니다!

혹시 이번 실험에 적용한 working protocol에 문제가 있는지 한번 봐주실 수 있을지요??

Working protocol

 - 65ºC로 heating block 설정하기

 - 1.5ml tube의 무게로 영점 잡기

 - Agarose gel에서 desired band cutting 후 1.5ml tube에 넣기

 - gel slice의 무게 측정 후 x3배 용량의 Gel extraction buffer 첨가

    (Gel slice 100mg이면 Gel extraction buffer 300ul 첨가)

 - 1.5ml tube에 담긴 Gel slice + Gel extraction buffer를 65ºC heating block에서 5~10분간 incubating (2분 마다 inverting하면서 녹았는지 확인)

 - 완전히 녹은 solution을 spin column에 넣고 1분간 13000rpm으로 room temperature에서 centrifuge

 - Collection tube에서 flow through버리고 column을 다시 collection tube에 장착

 - 750ul의 wash buffer(added EtOH)를 column에 넣고 1분간 13000rpm으로 centrifuge후 collection tube의 flow through버리고 column을 1.5ml tube에 장착

 - 잔여의 wash buffer를 column에서 제거하기위해 5분간 13000rpm으로 centrifuge 후 EtOH 날아갔는지 냄새 맡고 확실히 날아가도록 1분간 cap을 열고 room temperature에서 stand by

 - Column을 새로운 1.5ml tube에 옮기고 DEPC water(autoclaved) 15ul을 column 중앙에 정확히 떨어 뜨리고 1분 기다린 뒤 3분간 13000rpm으로 centrifuge한 뒤 4ºC 냉장 보관된 PCR 랙에 올린 뒤 전기영동으로 Band 확인

문제가 되지 않을까 예측되는 내용들

Original protocol에는 heating block을 50~55ºC로 설정하라고 나와있습니다. 

Gel slice의 무게를 재고 첨가해야할 Gel extraction kit의 volume을 계산하면서 그리고 gel extraction buffer를 즉시 사용할 수 있도록 준비하지 못하여 1분가량 시간이 지난뒤에 Gel extraction buffer를 첨가하였습니다. 

65ºC heating block으로 녹이는 과정에서 확실히 녹이기 위해 조금 과하게 heating 한 것이 아닌가 하는 생각이 들었습니다. 

Original protocol에는 Column에서 wash buffer를 제거하기 위해 1분간 full speed로 centrifuge하라고 명시되어 있으나 5분간 centrifuge하였습니다.

Original protocol에는 30~50ul의 Elution buffer 또는 distilled H₂O를 column 중앙에 첨가하라고 명시되어 있지만 15ul의 DEPC water(autoclaved)를 사용하였습니다. 

마지막으로 Original protocol에는 1분간 기다린 뒤, 1분간 maximum speed로 centrifuge하라고 명시되어 있지만 3분간 centrifuge하였습니다. 

혹시 문제가 될만한 내용이 있어 조언해주신다면 정말 감사히 배우겠습니다!

protocol에서 조금 변경할 내용

1. 온도는 별 문제 없을 것을 보입니다.

2. washing 후 filter cup을 tube에 넣지 말고 실온에서 5분간 dry

3. elution 시 DNA양에 따라 다르지만 25ul X 2회 elution.

- 에탄올이 완전 건조된 filter에 25ul 멸균수를 넣고 37도에서 5분간 보관 후

원심분리.

- 25ul 멸균수를 한번더 넣고 37도에서 5분간 보관 후

원심분리.

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- Original protocol에는 heating block을 50~55ºC로 설정하라고 나와있습니다. 

: 현재 온도도 별문제 없을 것으로 보이지만 60도 정도로 해보세요.

- Gel slice의 무게를 재고 첨가해야할 Gel extraction kit의 volume을 계산하면서 그리고 gel extraction buffer를 즉시 사용할 수 있도록 준비하지 못하여 1분가량 시간이 지난뒤에 Gel extraction buffer를 첨가하였습니다. 

: 별 문제 없습니다.

- 65ºC heating block으로 녹이는 과정에서 확실히 녹이기 위해 조금 과하게 heating 한 것이 아닌가 하는 생각이 들었습니다. 

: 현재 온도도 별문제 없을 것으로 보이지만 60도 정도로 해보세요.

- Original protocol에는 Column에서 wash buffer를 제거하기 위해 1분간 full speed로 centrifuge하라고 명시되어 있으나 5분간 centrifuge하였습니다.

: 별 문제 없습니다.

- Original protocol에는 30~50ul의 Elution buffer 또는 distilled H₂O를 column 중앙에 첨가하라고 명시되어 있지만 15ul의 DEPC water(autoclaved)를 사용하였습니다.

: DNA에는 멸균수를 사용하세요.

볼륨은 DNA에 따라 다르지만 20~25ul X 2회 elution하세요. 

- 마지막으로 Original protocol에는 1분간 기다린 뒤, 1분간 maximum speed로 centrifuge하라고 명시되어 있지만 3분간 centrifuge하였습니다. 

: 별 문제 없습니다.