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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 primer 주문하려고 합니다. PCR에 대한 간단한 자문을 구하고 싶습니다.
알비행기(과기인)  | 06.26 16:06

안녕하세요.

제가 생물학에 기본적인 지식만을 가지고 있고, 실험은 아직 많이 진행하지 못해본 초보입니다.

 

독학을 통해 공부하여 따로 자문을 구할 박사님들과 교수님들이 없어, 회사에도 연락을 해보았지만 만족하지 못할 답변을 얻어, 제가 많은 정보를 얻어간 BRIC에 글을 올리게 되었습니다.

 

초보이지만 유전자 클로닝 실험을 설계해야 해서 조금 막막한 감이 있습니다.

 

질문 몇가지 있어 조언 부탁드립니다.

 

우선 제가 하려는 실험은 Ecoli Gene cloning 을 진행하려고 준비를 마쳐놓았습니다.

우선 vector로 준비한 plasmid는 pgex-6p-1 이고,

pGEX-6P-1 Sequence and Map

insert vector는 형광을 띄는 단백질을 만들어내는 pZsGreen1-C1 Vector을 사용하려고 합니다.

upload_image

유전자를 재조합하여, GST - ZsGreen으로 연결된 단백질을 얻어, GST regin에 거른 후 blotting 과 활성 반응 두개를 실험해 보려고 합니다.

제한효소는 EcoR 1, BamH 1 을 사용하려고 합니다. (혹시 pgex vector에서 위치 차이가 10밖에 나지 않아 제한효소 처리에 오차가 생길 수 있는 여부가 있을까요?)

 

1. 실험과정 질문

 insert vector를 만들 때

가. 위와 같은 plasmid를 제한효소로 자른 후 gel에 내리고 extraction 하여 PCR을 진행한다.

나. plasmid를 PCR한 후 제한효소로 자른 후에 gel extraction을 진행한다.

전자의 방법으로 실험방법을 들었지만, 후자의 경우도 가능할 것 같아 질문드립니다.

 

2. Primer 주문

 Primer를 제작이 아닌 주문하려고 하는데, 위와 같이 시퀀싱정보는 다알고 있는 상태입니다. 

 Primer를 사용할 때 앞에 더미 부분이 필요하다는 이야기를들었습니다.

회사에 문의한 결과 PCR할때는 보통 20개의 염기서열을 달라고 들었습니다.

20개안에 더미부분이 포함인지, 더미는 어느 정도 설정하는게 알맞은지 궁금합니다.

그리고 1번의 전자와 같이 잘라준 후 PCR하는 경우 primer 주문할때 BamH1 유전정보 끝과 정확히 맞추어 주문하는 것인지, 그앞 유전정보의 여유를 주어 primer를 제작하는 것인지, 더미부분이 어떻게 포함시켜 진행해야하는지가 궁급합니다.

(사실 primer 주문부분이 막혀 글을 올리게 되었고, primer 주문을 어떻게 진행해야하는지 알려주셨으면합니다.)

3. 실험과정 자문

가.  제한효소 처리 - 전기영동(insert 유전자 분리) - gel extraction - PCR - 전기영동(확인) - gel extraction(확인) - ligation - transformation - plate culture - seed/main culture - prep - agarose 전기영동(dna 크기 확인) - plate reader or chemidoc(발현 확인) - sonication - 분획 - LC(gst regin) - SDS-PAGE - Western blotting(gst 확인) 

나. PCR - 제한효소 처리 - gel extraction - ligation 부터는 동일합니다.

혹시 실험설계에서 잘못된점이 있을까요.......?

 

긴글 봐주셔서 감사합니다.

주변에 자문할 분이 안계셔 글을 남겨봅니다.

만약 관련 자료가 있으시다면 링크라도 주시면 제가 열심히공부해보겠습니다.

그리고 질문 2번 Primer 주문하는데 있어 바이오니아 회사에서 주문하려고 했지만

https://www.bioneer.co.kr/oligo-dna-customorder.html

여러가지 옵션을 넣는것이 많아 질문을 남기게 되었습니다.

 고수님들 잘 부탁드립니다.

 

#primer
 
#pcr
 
#gene cloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리금상품권  |  06.26 17:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

질문이 많으시군요, 

옆에 물어볼 사람이 없으면, 참으로 난감하고, 

힘들죠... 

 

제한효소는 EcoR 1, BamH 1 을 사용하려고 합니다. (혹시 pgex vector에서 위치 차이가 10밖에 나지 않아 제한효소 처리에 오차가 생길 수 있는 여부가 있을까요?)

: 그 정도 차이는 상관없습니다. 하지만, cloning시 최대한 enzyme site을 안남기시는 것을 추천드리고 싶습니다. 

 

1. 실험과정 질문

 insert vector를 만들 때

가. 위와 같은 plasmid를 제한효소로 자른 후 gel에 내리고 extraction 하여 PCR을 진행한다.

나. plasmid를 PCR한 후 제한효소로 자른 후에 gel extraction을 진행한다.

전자의 방법으로 실험방법을 들었지만, 후자의 경우도 가능할 것 같아 질문드립니다.

: insert vector를 만든다는게 어떤 의미이신지요?

위에 글을 제가 잘 이해를 못했는데, 이미 target gene이 있는 vector가 있고, 

이것을 expression vector에 ligation 하신다는건가요?

 

2. Primer 주문

 Primer를 제작이 아닌 주문하려고 하는데, 위와 같이 시퀀싱정보는 다알고 있는 상태입니다. 

 Primer를 사용할 때 앞에 더미 부분이 필요하다는 이야기를들었습니다.

회사에 문의한 결과 PCR할때는 보통 20개의 염기서열을 달라고 들었습니다.

20개안에 더미부분이 포함인지, 더미는 어느 정도 설정하는게 알맞은지 궁금합니다.

그리고 1번의 전자와 같이 잘라준 후 PCR하는 경우 primer 주문할때 BamH1 유전정보 끝과 정확히 맞추어 주문하는 것인지, 그앞 유전정보의 여유를 주어 primer를 제작하는 것인지, 더미부분이 어떻게 포함시켜 진행해야하는지가 궁급합니다.

(사실 primer 주문부분이 막혀 글을 올리게 되었고, primer 주문을 어떻게 진행해야하는지 알려주셨으면합니다.)

: 5', 3'에서 시작하는 두개의 primer를 제작하시면 되고, 

 시작 부분에 enzyme site만 넣으시면 됩니다. 

 20 mer를 초과안하면 좋지만, 30 mer 이하면 충분합니다. 

 주의하셔야할 것은 상보적인 sequence를 넣어야하니, 

3' 부분의 primer는 상보적으로 그리고, 거꾸로 시작을 한다고 보면 되고, 

primer3라는 무료 site도 있으니 이용해 보셔도 됩니다. 

(최근에는 primer 제작 회사에서도 제공합니다)

 

 

3. 실험과정 자문

가.  제한효소 처리 - 전기영동(insert 유전자 분리) - gel extraction - PCR - 전기영동(확인) - gel extraction(확인) - ligation - transformation - plate culture - seed/main culture - prep - agarose 전기영동(dna 크기 확인) - plate reader or chemidoc(발현 확인) - sonication - 분획 - LC(gst regin) - SDS-PAGE - Western blotting(gst 확인) 

나. PCR - 제한효소 처리 - gel extraction - ligation 부터는 동일합니다.

혹시 실험설계에서 잘못된점이 있을까요.......?

: PCR을 수행해면 대게 poly A tailing이 생기고, 이에 TA cloning, A를 잘라내는 과정을 거치게 됩니다. 그 과정이 빠져있는 것 같습니다. 

PCR - gel loading-band elution-T-vector ligation -transformation-blue/white colony selection 또는 colony PCR-culture-DNA prep-enzyme digestion- gel loading-band elution-expression vector ligation - selection (PCR, enzyme digestion....) -culture - DNA prep - transformation (expression E.coli) - 등으로 진행이 일반적입니다..

알비행기  |  06.27 17:06  

답변 정말 감사드립니다.

제가 명칭이 몇개는 생소해서 조금 공부하느라 늦었습니다. 많이 부족하다는 것을 계속 느끼고 있습니다.

(이렇게 친절하게 빠르고 자세히 알려주실지 몰랐습니다. 메일로 알려주신다는분 연락을 취했어야 했는데, 죄송합니다. ㅠ)

제가 전혀다른용어를 쓰고 있는 것도 있고 하여 민망하네요.

 

1. 실험과정 질문

위에 글을 제가 잘 이해를 못했는데, 이미 target gene이 있는 vector가 있고,  이것을 expression vector에 ligation 하신다는건가요?  

gst가 있는 expression vector(pgex vector)에 zsgreen에 있는 target gene를  ligation 시키려고 합니다. 

 

2. Primer 주문

: 5', 3'에서 시작하는 두개의 primer를 제작하시면 되고, 

 시작 부분에 enzyme site만 넣으시면 됩니다. 

 20 mer를 초과안하면 좋지만, 30 mer 이하면 충분합니다. 

 주의하셔야할 것은 상보적인 sequence를 넣어야하니, 

3' 부분의 primer는 상보적으로 그리고, 거꾸로 시작을 한다고 보면 되고, 

primer3라는 무료 site도 있으니 이용해 보셔도 됩니다. 

(최근에는 primer 제작 회사에서도 제공합니다)

 

감사합니다!

1개의 제한효소를 사용할 경우 3'5' 의 primer를 다르게 설정(거꾸로, 상보적으로를 생각하여 설정),

2개의 제한효소를 이용할 경우 되면 3' 5' enzyme site를 다르게 상보적으로 설정.

(site는 말씀해주신데로 들어가 보았습니다. 아직 저한테 어려워서 공부중입니다. 감사합니다)

 

3. 실험과정 자문

 

: PCR을 수행해면 대게 poly A tailing이 생기고, 이에 TA cloning, A를 잘라내는 과정을 거치게 됩니다. 그 과정이 빠져있는 것 같습니다. 

가. PCR - gel loading-band elution-T-vector ligation -transformation-blue/white colony selection

나. colony PCR-culture-DNA prep-enzyme digestion- gel loading-band elution-expression vector ligation - selection (PCR, enzyme digestion....) -culture - DNA prep - transformation (expression E.coli) - 등으로 진행이 일반적입니다..

 

A를 잘라내는 과정은 다시 제한효소 처리를 하면 될까요? 

가. 과정은 TA clonig이라는 기술을 말씀하시는게 맞나요?

나.에서 colony PCR 방법을 처음으로 알게되었습니다. 저는 두개의 plasmid를 prep 하여 target gene를 PCR 한뒤 ligation 하려고 했었습니다. 감사합니다.

selection 과정에서 괄호에 들어가있는 과정(pcr, enzme digestion... )등을 진행해주어야 하는 것인가요? 

 

제한효소로 잘라주는 전통적인 방법만 알고 있었습니다.

제가 어느정도 알고 있어야 질문이 되고 답변을 들어도 이해가 될텐데; 

도움을 주시는데 제가 그만큼 따라가지 못하여 죄송합니다.;;

새로운 방법과 여러가지 기본지식도 쌓을 수 있게되었습니다.

감사합니다.

개구리금상품권  |  06.29 10:50  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

전혀 죄송하실 필요 없습니다~

처음에 모르는게 당연하지, 

처음부터 아는게 매우 이상하겠지요 ^^

 

3. 실험과정 자문

A를 잘라내는 과정은 다시 제한효소 처리를 하면 될까요? 

가. 과정은 TA clonig이라는 기술을 말씀하시는게 맞나요?

: TA cloning은 T-vector에 ligation하여, 다시 enzyme digestion후 insert를 확보하는 기술입니다. 

물론 primer를 조금 길게 설정해서, PCR 후 PCR product를 직접 자르는 방법도 있지만, 성공률이나 정확도가 좋진 않아서, 

아직도 T-vector를 이용한 TA cloning을 한번 거칩니다.

 

나.에서 colony PCR 방법을 처음으로 알게되었습니다. 저는 두개의 plasmid를 prep 하여 target gene를 PCR 한뒤 ligation 하려고 했었습니다. 감사합니다.

: 이것은 인터넷에 많이 나와있습니다. 굳이 prep을 할 필요가 없어서, 실험하는 입장에서는 요긴하게 사용됩니다. (주의할 것은 colony가 없는 배지를 control로 하고, cycle을 30이 넘지 않게 설정해야합니다)

이것도 완벽하진 않기 때문에, colony PCR 후, enzyme digestion 으로 확인하셔야합니다. 이를 screening이라고도 말하기도 합니다. 

 

selection 과정에서 괄호에 들어가있는 과정(pcr, enzme digestion... )등을 진행해주어야 하는 것인가요? 

: 넵. ligation은 확률 싸움입니다. 그리고 그 성공확률이 생각보다 낮습니다. 모두 맞다고 확인을 하여도, sequencing에서 틀리는 경우가 많습니다. 

 

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