실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
protein 발현정제의 총 volume에 따라서 정제의 차이가 보입니다.
레벨2 chaeyeonim (대학생)
안녕하세요, 선생님들.
제가 이번에 protien 발현정제를 하는데, 새롭게 protein scaffold를 하기 위해서 1,2,3번의 단백질을 각각 정제를하면서 이상한 점을 발견하였습니다.
first, 1번 단백질을 100mL large culture를 하여, mini_Ni-NTA를 하였을 때는 elution에서 굉장히 굵은 band를 확인 할 수 있었습니다(SDS-PAGE에서). 근데 이것은 test용이고, 이 data를 바탕으로 1L를 발현 정제를 하였는데 elution에서 band를 확인할 수 없었습니다. 이 부분이 왜 그런지 궁금합니다.
second, 2번 단백질의 경우 7% imidazole washing을 하고, 100% imidazole washing을 통해 결론적은 100%에서 interest protein을 얻고자 하는데 이것을 위의 1번 단백질과 마찬가지로 1L를 발현정제를 했더니 잘 나오지 않아, washing percent를 gradient를 한 결과 17%에서 interest protein을 얻을 수 있었습니다. 2번 단백질이 17% imidazole이 optimum percent라고 결론을 내릴 수 있겠지만, 보통 17%<100%에서 protein이 더욱 잘 확인할 수 있는것이 아닌가 하고 질문드립니다.
third, 3번 단백질은 Ni-NTA를 후, SEC(superdex75사용)를 하고 나서도 여전히 다른 잡밴드가 보여서 이것을 더 잘 분리할 수 있는 방법이 없는지 질문드립니다.
제가 생명정보나 생명분석학 전공이 아니라 완전히 다른 전공이고, 대학원에 입학하면서 공동연구를 하게 되면서 단백질 발현정제를 배우게 되었습니다. 그래서 많이 부족해보이는 질문이지만, 답변해주시면 감사하겠습니다.
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