현재 추출 방법은 어떻게 하나요?
그리고 silver staining 결과는 어떻게 나왔나요?
Phenol (pH 8.0) 처리 후,
상등액을 RNase, DNase 처리하고
이후에 Proteinase K를 첨가한 후, overnight 반응시킵니다
이를 다시 phenol 추출 한 후,
Ethanol precipitation 하여, LPS를 추출하였습니다
이후, 15% acrylamide gel에 10 ul loading하여,
silver staining을 진행하였는데,
첨부파일과 같이 나옵니다
분리가 전혀 안되었네요.
분리 방법이 너무 간단하게 설명이 되어 있어 문제점 발견이 쉽지 않습니다.
균체를 원심 분리 한 후 버퍼로 2회 washing을 해 주는것이 좋습니다.
효소 처리는 페놀 추출 앞 단계에 해야합니다.
페놀 추출은 어떻게 했나요?
제일 중요한 단계입니다.
침전은 에탄올만 가지고 했나요?
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레벨1
ESC
(대학원생)
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20.06.29 17:27
예전에는 잘 되던 실험이었는데, 갑자기 안되네요.
끓여서도 해보고, 페놀처리후 정제도 해보고,
페놀이 문제인거 같아서, water saturated phenol도 써보구,
RNA용 phenol, DNA 용 phenol도 써 봤는데 잘 되질 않습니다. ㅠㅠ
기존에는 어떤 페놀은 사용했나요?
추출용은 saturated phenol을 사용해야 합니다.
LPS 추출은 잘됩니다.
protocol이 아직 최적화되지 않은것 같네요.
아래의 논문을 참고하여서 밑의 protocol대로 실험을 진행하였는데
Phenol을 Tris-saturated, water-saturated 둘다 사용해 보았으나
결과가 똑같이 나왔습니다
The Wzy O-antigen polymerase of Yersinia pseudotuberculosis O:2a has a dependence on the Wzz chain-length determinant for efficient polymerization
① A 10-ml culture (OD600 nm = 0.5).
② Cells were obtained by centrifugation and were resuspended in 200 μL of TAE and 400 μL LPS lysis buffer (100 mM SDS, 50 mM Tris, 0.128 mM NaCl).
③ The samples were mixed with an equal amount of phenol/chloroform (1 : 1)
④ Heated at 65 °C for 15 min.
⑤ LPS was extracted from the aqueous phase by adding an equal amount of ice-cold ethanol and retrieving the precipitate by centrifugation.
⑥ Precipitate was resuspended in 200 μL of 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)
⑦ Nucleic acid was removed by digesting with DNase (0.6 μg μL−1) and RNase (0.6 μg μL−1) at 37 °C for 45 min
⑧ Protein removal by proteinase K digestion (1.2 μg μL−1) at 56 °C for 1 h.
⑨ LPS was precipitated from the aqueous phase once more and resuspended in 40 μL distilled water.
문제가 될만한 부분이 있을까요?
① A 10-ml culture (OD600 nm = 0.5).
: O/N culture하면 됩니다.
OD값이 1이상 나오는데 무방합니다.
② Cells were obtained by centrifugation and were resuspended in 200 μL of TAE and 400 μL LPS lysis buffer (100 mM SDS, 50 mM Tris, 0.128 mM NaCl).
: 배양액 2ml를 1 tube에 원심분리
50mM Tris buffer, pH7.5로 2회 균체 washing.
500ul lysis buffer(1% SDS, 50mM Tris buffer pH7.5, 1mM EDTA)
inverting 10회
60도 30분 heating
③ The samples were mixed with an equal amount of phenol/chloroform (1 : 1)
inverting 10회, 65도 10분, 3회 반복
④ Heated at 65 °C for 15 min.
: 생략
원심분리 13krpm, 20분
상등액 회수
⑤ LPS was extracted from the aqueous phase by adding an equal amount of ice-cold ethanol and retrieving the precipitate by centrifugation.
2부피 EtOH 혼합
-80도 30분
원심분리 13krpm, 20분
EtOH제거 및 dry
⑥ Precipitate was resuspended in 200 μL of 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)
⑦ Nucleic acid was removed by digesting with DNase (0.6 μg μL−1) and RNase (0.6 μg μL−1) at 37 °C for 45 min
⑧ Protein removal by proteinase K digestion (1.2 μg μL−1) at 56 °C for 1 h.
⑨ LPS was precipitated from the aqueous phase once more and resuspended in 40 μL distilled water.
: 2부피 EtOH 혼합
-80도 30분
원심분리 13krpm, 20분
EtOH제거 및 dry
50ul, 20mM Tris buffer, pH7.5 용해
10ul SDS-PAGE, silver staining
위 방법으로도 잘 안나오면 다른 방법을 알려 드리겠습니다.
알려주신 방법대로 LPS 추출 후, 전기영동해보았는데
여전히 ladder가 잘 나오지 않더라구요
왼쪽사진은 10 ul loading한 것이고
오른쪽 사진은 이를 5배, 10배, 15배, 20배 30배, 40배, 50배 희석하여 loading한 것입니다
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레벨1
ESC
(대학원생)
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20.07.08 11:46
알려주신 방법대로 했는데
한번은 페놀넣고 vigorous vortexing하였더니 위 그림의 끌리는 것도 보이지 않아서
두번째는 페놀 후 손으로 inverting만 하였더니 위의 그림처럼 나왔습니다.
페놀 핸들링도 중요한거 같고, 혹 버퍼를 autoclave해야하나 생각도 드는데, 분해되는거 아닌가 싶어서
그리고 실버스테이닝 develop하는 과정에서도 LPS가 아주 천천히 보이게 되나요?
한참을 기다려야 smearing한 것들이 보이더라구요 ㅠㅠ
추출이 거의 안되었네요.
1, 2 이후 7, 8을 진행.
3에서 tris saturated phenol을 동일 부파 사용하여 혼합 후 10초 vortex,
65도 15분 유지.
원심분리 13k, 10분, 상등액 회수
4. 페놀 : 클로로포름(1 : 1)을 동량 혼합 후 원심분리, 상등액 회수
5 이하 진행(7, 8은 생략)
위와 같이 한번 해보세요.
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레벨1
ESC
(대학원생)
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20.07.11 18:42
단계별 문제점 체크하면서 어찌어찌 하여 LPS 분리 성공했습니다. ㅎㅎ
diethyl ether사용했습니다.
감사드립니다.