실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Transformation
Plasmid의 amplify할 때 recombination 문제
레벨1 이소현 (과기인)
pcDNA3 plasmid 에 human SCN9A CDS (6kb)가 들어가 있음. (총 11kb)
human SCN9A의 site mutagenesis를 하려고 함.
site mutagenesis를 하려고 하는 부분은 SCN9A의 앞쪽 3kb안에 2군데를 하려고 함.
site mutagenesis하기에 vector 크기가 너무 커서, SCN9A를 1.5kb와 2kb로 나눈 후 pBluescript Sk(+) vector에 각각 넣은 후 site mutagenesis를 잘 끝냄.
잘 끝낸 SCN9A 2개의 fragment를 다시 원래 plasmid인 pcDNA3-SCN9A에 넣으려고, ligation하고 transformation 한 후 확인해보니, site mutagenesis 하지 않는 SCN9A 뒷부분에서 recombination이 일어남.
제가 진행해본 transformation방법은
에서 해보니, 모두 같은 region에서 recombination이 일어났음.
또 다른 이상한 점은, 이 실험을 하기 전에 pcDNA3-SCN9A WT plasmid를 amplify 하였을 때 이상 없었음. 하지만, mutagenesis 끝나고 실험이 계속 되지 않아, 다시 pcDNA3-SCN9A WT plasmid를 amplify를 하였더니, 원래 vector 마저도 같은 region에서 recombination이 일어남.
(이 역시 DH5a, DH10b: 37도, 30도 모두 진행함)
선생님들,
혹시 여기서 뭐가 문제가 있을까요??
어떠한 방법으로 하면 이 문제를 해결할 수 있을까요?
좋은 답변 기다리겠습니다. 감사합니다.
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