4번 LiCl은 RNA 용액의 1/10만 넣어 주면 됩니다.
4번 RNA용액 + 1/10 LiCl + 1부피 iPA를 넣고 잘 혼합 후 원심분리를 해야
합니다.
극성 유기용매가 없으면 RNA 침전이 안됩니다.
RNA 순도가 안좋으면 1번 다음에 산성 phenol buffer로 1회 추출 후
chloroform:IAA 추출을 하면 순도가 올라갑니다.
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(대학원생)
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20.06.11 17:16
먼저 답변 감사드립니다!
4번에서 IPA도 첨가 뒤 overnight 후 centrifuge를 해보고, 그래도 충분히 안되면 sample과 buffer량을 늘려보는 것이 좋겠죠?
혹시 pellet이 보이지 않는 것은 RNA가 침전이 되지 않아서 그런 것일까요?
감사합니다.
지난번에 최적화가 필요하다고 언급을 했었는데요,
우선 RNA가 샘플에서 나왔다는 것을 확인한 다음에 LiCl 침전 이후를 진행하는 것이 좋을 것 같습니다.
방법으로서, Chloroform:IAA 추출을 1회만 한 후에 바로 1/10 volume 3M NaOAc, 1 volume IPA를 넣고 잘 섞은 다음 얼음에 10분정도 냉각시키고 원심분리로 침전시켜 보세요. 이때 pellet이 형성되어야 하겠죠. 침전이 보이면 75% EtOH wash하고서 50 ul DEPC water에 녹이고 1kb plus마커와 같이 1% 아가로스 젤에 걸어 보세요. genomic DNA외에 rRNA 밴드가 두 개 뚜렷이 보이면 된 겁니다.
RNA/LiCl 침전은 보통은 알콜없이 2.0-2.5M 농도로 처리합니다. 알콜을 추가하면 효율은 높아지지만 품질이 안좋습니다. 정 안나오면 알콜 침전을 해야겠죠. 이 단계에서 다시 아가로스전기영동으로 확인합니다.
Botrytis에 감염된 딸기과실은 다뤄보지 않았기 때문에 단언할 수는 없는 것이지만, 꼭 되니까 실망하지 말고 여러번 시도해 보시길 바랍니다.
제가 구글을 해보니까 red fruit에 감염 24시간 후 샘플을 RNA-seq 분석한 논문이 있었어요. 망고과실에 개발되었던 SDS/borate 버퍼를 사용했던데, 이게 hot borate와 거의 비슷한 조성이더군요. 추출온도만 상온으로 달리했습니다. CTAB이 안되면 이것도 시도해 보시기 바랍니다. 펄프가 많은 조직에서 효율이 굉장히 좋습니다. 저는 CTAB이나 hot borate나 샘플특성에 맞게 수정을 해 주면 다 비슷하다고 봅니다.
- IPA도 첨가 뒤 overnight 후 centrifuge를 해보고, 그래도 충분히 안되면
sample과 buffer량을 늘려보는 것이 좋겠죠?
: LiCl or NaOAc + iPA 혼합하면 5분 뒤에 원심분리 돌려도 충분히 침전됩니다.
- pellet이 보이지 않는 것은 RNA가 침전이 되지 않아서 그런 것일까요?
: 네. iPA가 없어서 RNA 침전이 안됩니다.
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(대학원생)
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20.06.11 17:41
두분 모두 감사드립니다!
IPA넣어서 다시 시도해볼게요!
감사합니다
제가 방금 위에 댓글을 달았는데요 (책임감이 느껴져서요), LiCl 침전을 하기 전에 바로 IPA 침전을 먼저 해보세요. RNA 추출이 되었는지 확인하고 넘어가자는 거예요.
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닉네임0115
(대학원생)
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20.06.11 22:51
논문까지 찾아주시고 감사합니다!
구글에서 원리도 찾아보려고 노력하고있어요
포기하지않고 여러방법 시도해볼게요ㅠㅠ
감사합니다!
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(대학원생)
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20.06.15 15:31
IPA 넣어서도 시도해봤는데.....안뽑히네요ㅠㅠ이번에도 pellet이 안보였어요...
방법은
1. sample 100mg+CTAB buffer 0.7ml, vortexing for 30s 후 65도 water bath에서 30min 간 incubation
2. chloroform:IAA 0.7ml 넣고 30s vortexing, 10000rpm에서 5min centrifuge
3. supernatant (3개층으로 분리되었을 때 가장 위층) 다른 tube에 옮긴 뒤 2번 반복
4. supernatant (2개 층으로 분리됨) 다른 tube에 옮긴 뒤 0.07ml 10M LiCl과 0.7ml Isopropanol 넣고 손으로 흔든 뒤 10min -20도에서 incubation
5. 10000rpm에서 20min centrifuge 후 액체부분 pipet으로 뽑아 버린 뒤 40마이크로리터 water에 넣음 (ethanol wash하다가 손실될까봐 바로 해봤어요)
인데요...
이정도면 sample에 문제가 있는 걸까요? 처음 grinding이라던가..양이라던가...
새글로 올릴지 여기에 달지 고민하다가 일단 여기에 먼저 올려봐요! 감사합니다!
5번 단계에서 원심분리 후 tube 밑에 RNA가 보여야 합니다.
pellet이 안보이면 RNA도 안나옵니다.
2번 단계에서 클로로포름으로 추출이 힘들것 같이 보이며 phenol 처리를 하는
것이 좋을 듯 합니다.
어려운 일일 수록 도전할 가치가 큰 거죠.
포기하지 말고 더 나아가세요. 염려스러운 것은 테스트 한다고 샘플을 다 소비해 버리는 불상사인데요, 여분의 시험용 샘플을 따로 준비해서 조건을 잡아야 할 거예요.
이 정도면 질답이 아니라 컨설팅이 필요한 수준인데요. 의심해야 할 단계도 많고요. 우선은, 샘플 처리와 알콜 침전 사이의 1~3 단계를 따져 봐야겠죠.
저의 앞선 제안인 시험용 알콜 침전은 3번째 단계, 그러니까 chloroform 추출을 1회 한 후, 거기에 1/10vol NaOAc (0.3M), 1 vol IPA를 넣어서 -20도에 1시간 정도 냉각 한 다음, 최대 속도로 원심분리를 해보라는 거였습니다. LiCl 침전을 하기 전에 먼저 확인해 보라는 거죠. 알콜침전에 LiCl은 효율이 낮습니다. Ambion technical bulletin 중에 Use of LiCl precipitation for RNA purification이라는 문서를 고찰해 보세요.
- 샘플이 RNA가 들어있는 살아있는 조직인지? 살아만 있다면 RNA는 어떻게든 나옵니다.
- 샘플에 물 함량이 높은지? 실제 세포의 양으로는 어떨지? 추출버퍼가 희석된 것은 아닌지? 500mg~1g 정도로 막자 사발에 갈거나 비드비팅, 버퍼를 5 ml 이상 충분히 넣어 분해시킨다면?
- CTAB 버퍼는 미리 데워놓고(온도가 65도 이상이면 변성이 옴), b-mercaptoethanol을 0.5~2% 정도로 높게 첨가함. 추출 후 pH 변동 가능성은? 이 경우 pH 지시약 (cresol red) 약간 넣어서 확인 (포도나 귤 처럼 신맛이 강한 재료는 유기산 때문에 pH가 떨어져서 분해가 잘 안되었고, pH를 올려서 성공).
- Lysis가 충분히 되었는지? 중간에 자주 vortex (2-3분 마다). Water bath에서 실험하면 RNAse 오염 위험이 있어요. dry block이나 oven 권장합니다.
- Pulp나 고분자 polysaccharides 간섭이 느껴지면 insoluble PVPP를 PVP40과 같은 농도로 보충.
- 알콜 침전 단계에서 젤이 형성되면 salt 농도를 높여서 RNA 침전을 분리시켜줘야 합니다. 과실 시료에서 이 부분이 핵심이라고 생각합니다. 젤이 생기면 핵산 침전이 바닥에 잘 붙지 않습니다. 또 polysaccharides 사슬이 핵산의 구조와 상당히 비슷하기 때문에 비특이적인 무작위 결합을 단단히 형성합니다. 일단 둘이 붙고 나면 분리해내기 어렵기 때문에, 이 첫번째 침전단계에서 젤이 형성되지 않도록 salt 농도를 조절하고, 침전시킬 때 물리적인 액션(흔들어서 두종류의 침전덩어리가 따로 떨어지도록)을 가하거나 해야 합니다.
Trizol이나 RNeasy 컬럼 써서 나오는 샘플이 아니면 매번 최적화를 해 나가야 하는데 결과에 대한 확신이 없으면 불안하기도 하고, 시행착오가 반복되면서 지루한 일이 되기도 합니다. 그런데 그 과정에서 남들이 제시한 방법과 결과를 자세히 검토해 볼 수 있겠고, 이 실험의 기본부터 여러 측면을 생각해보는 기회도 될 거예요. 힘들 때 웃으시고요! 아직은 목적지에서 멀은 것 같네요.
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닉네임0115
(대학원생)
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20.06.16 18:21
sample은 여러 개 있어서 괜찮은데 신경쓸 것이 많네요ㅠㅠ
사진 정도로 죽어있는 sample인데, 여기서 접종 부위 주위쪽 부분을 뽑고있엇 죽어버려서 RNA가 없을수도 있으니 sample에 있어서도 조절을 해보고, 여러 단계에서 계속 바꿔가며 시도를 여러번 해보아야할것같아요ㅠㅠ
도와주셔서 정말 감사합니다!!!