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SP2를 이용한 고전적인 방법이신가요?
mouse spleen을 이용해서,
seed cell을 사용하시는지요?
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레벨3
sh1227
(대학원생)
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20.06.11 16:14
저는 지금 이러한 과정으로 실험을 하고 있는데 퓨전 후 콜로니가 생성이 되지않아서 문제입니다.
Spleen을 적출해서 RPMI 1640을 3ml 정도 담아 놓은 6cm dish에 놓는다.
Slide glass 2개를 이용해서 3등분을 해 놓고, 잘게 부순 spleen이 들어 있는 RPMI 1640을 거즈를 이용하여 15ml tube에 담는다. 1500rpm, 5분, 25도의 조건으로 원심분리 한다. (Myeloma 같이 원심분리 한다.)
Cell counting (splenocyte (대개) 1.0x10^8/total, Myeloma 2-3x10^7 cells)
Myeloma : splenocyte = 1 : 5~10 의 비율로 섞습니다.
그리고 37℃에서 1분 동안 PEG 1ml을 넣어 주고, RPMI 1640 2ml을 1분 동안, RPMI 1640 7ml을 2분 동안 넣어 준다 그 후. 원심분리하고 hybridoma medium 넣어 준다음.
culture용 96well plate에 100ul/well씩 분주하고, overnight culture한 후, HAT medium (x2)를 100ul/well씩 분주한다. 1주일간 culture 하여 hybridoma colony가 뜨는지를 체크합니다.
고수님 어디가 문제인지 알려주세요
그리고 세포가 뭉침현상이 심한이유도 알려주세요