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추출한 DNA는 전기영동 해봤나요?
그리고 template DNA는 몇 ng정도 사용했나요?
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레벨1
BEES
(일반인)
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20.06.07 16:47
추출한 dna량은 측정 못해봤습니다 장비가 없어서.. 하지만 같은 샘플 다른 primer(조건도다름)를 썼을땐 밴드가 나옵니다
72도 증폭 40초 그리고 35사이클로 실험해보세요
Temp. DNA양이 많은것 같으니 1/5, 1/10로 줄여서 비교해 보세요.
음....
어떤 DNA를 추출하신건지.....?
그리고 70 cycle 이 맞는지요??
위 결과는
non-specific 하거나, Et-OH와 같은 용액에 영향을 받아서
끌리는 현상이 나오기도 합니다.
Template 농도가 너무 높습니다.
1/20 이상 희석해서 사용해도 됩니다.
270bp 부근 밴드가 보이는 샘플이 있습니다.
사이클 수가 너무 많습니다. 2^n 계산으로 30번과 70번 차이를 계산해 보세요.
문제의 원인을 열거하지 못해도,
샘플들의 농도와 실험조건을 다시 잡아야 합니다.
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레벨5
CHINyo76_philekorea
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20.06.12 15:48
template 농도도 체크 해주시고,
Hot lid 105도 30초? ---> 체크
95도 9분 95도 30초 65도 30초 72도 1분 70사이클 Final 72도 9분 진행
- target length가 300 bp 이하라면 30초 정도면 충분하지 않을까요?
- 70 cycles; 35 cycle정도면 충분하다고 생각되면 개인적으로 40 cycles 이상으로 늘렸을 때 결과가 더 좋지 못했습니다. 아무래도 cycle 수가 늘어나더라도 primer와 amplified fragment가 annealing 때 경쟁관계를 형성할 수 있으며, 반응 시 pyrophosphate에 의해 polymerization에 저해를 줄 수 있습니다.