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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 BamHI/HindIII 처리 시 issue...
올챙이버그기(대학생)  | 06.06 12:37

이것저것 바꿔봐도 계속 같은 결과라 사진첨부하여 질문드립니다..ㅠㅠ

upload_image

총 6.7kb 정도의 construct에서 BamHI/HindIII를 처리하면 660bp의 insert가 잘려나와야 하는 구조 입니다. insert를 빼낸 vector가 필요합니다.

처음 cut 했을때 위 사진처럼 아래 밴드가 휘어져 나와서 젤 상의 문제인가 하고 윗밴드를 잘라 cloning 진행했는데 실패 했습니다.

한번 더 반복하였으나 같은 현상이 확인되어, enzyme과 reaction buffer 모두 새로 구매하고, DNA도 Q사의 kit 이용하여 새로 정제 하였습니다.

그렇게 해서 다시 digestion한게 위의 사진 입니다. (계속 같은 결과...)

까다로운 조건을 가질 것이 하나도 없는 실험이라 생각했는데 느닷없이 이런 문제에 봉착하니 난감합니다..

E.coli strain은 DH5a 사용합니다.

dcm/dam 영향 받는 enzyme들도 아니고... 대체 왜 이러는 걸까요?

construct를 DNA sequencing하여 원하는 위치에 BamHI/HindIII 서열이 모두 존재하는 것도 확인하였습니다. 이외에는 BamHI 또는 HindIII site 없습니다.

enzyme 처리할 때 glycerol 비율도 고려하여 5%이하로만 처리합니다.

왜 자꾸 아래 밴드가 휘어지는걸까요? 같은 젤에 running 한 다른 DNA들은 1kb이하 사이즈까지도 문제없이 clear하게 내려갑니다..

 

#restriction enzyme
 
#BamHI
 
#HindIII
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  06.06 13:10  

첨부 사진을 보면 660bp band가 안보이는데 예상하는 plasmid인가요?

elution용이 아닌 적은 양을 잘랐을 때는 660bp가 나오나요?

올챙이버그기  |  06.08 18:54  

SPEED님,

660bp의 insert가 튀어 나오는 것을 확인한 후 cutting된 벡터를 사용하기 위해서 이러한 실험을 하고 있습니다.

아랫밴드가 660bp 위치까지 내려가야 하는데
내려가지 못하고 1kb 윗부분에서 휘어지고 더이상 running이 되지 않는 현상 때문에 질문 하였습니다...

본문에 설명드린 것처럼, 같은 젤의 다른 well에 running한 작은 size의 DNA들은 660bp보다 더 작은 위치까지 잘 내려갑니다.

무슨 문제인건지 대체 이유를 모르겠네요..

대왕개구리SPEED  |  06.08 19:02  

gel 문제인지 elution용 으로 well을 길게 합쳐서 생긴 문제인지 확인하기 위해서

2개 band를 각각 elution 해서 작은 well로 전기영동 확인해 보세요.

아래 band가 660정도 나오면 위의 vector  band를 사용하면 될것 같습니다.

작은 well에서도 660이 안나오면 agarose를 바꿔서 실험해 보세요.

올챙이버그기  |  06.09 10:40  

agarose를 바꿔보라 하신 이유를 여쭤봐도 될까요?

같은 젤에 내렸다고 말씀드린 다른 DNA들도 다 elution해야해서(PCR product) 넓은 well을 사용했거든요...

일단은 말씀하신 것들 진행해 보겠습니다...!

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