실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Library
Phage display 후 insert가 deletion 되는것같습니다.
레벨1 LuvPit (대학원생)
Antibody를 screening 하기 위해서, pADL-20C vector에 nanobody 형태의 library를 제작하였습니다.
CDR3 부분을 random하게 하여 12~23개의 amino acid가 존재하도록 하였으며, 이는 colony PCR을 통해서 insert가 존재하는것을 확인했습니다.
현재는 sequencing을 진행하고 있는데, 분석이 안되는 것이 13개정도 존재하고, 중간에 stop codon이 존재하는게 15개정도, 나머지는 서열 분석이 되는것으로 보입니다. (아직 sequencing 진행중입니다.)
library size는 10^6 정도로 작지만, 실험을 익힐겸 panning을 진행하였으며, CM13 helper phage를 사용하여 진행하였습니다. 실험은 다른 랩실의 phage display를 하시는 분의 도움을 받아서 3 round까지 진행하였습니다.
phage ELISA (polyclonal ELISA)를 진행하였을 때 1-2 round에서보다 3 round에서 signal이 증가하는 것을 확인하였고, single colony로 풀어서 ELISA (monoclonal ELISA)를 하였을 때, 전부 (~200개 colony) background signal (흡광도 ~0.1)로 나타났습니다.
ELISA에 문제가 있었는지 확인하기 위해 colony PCR을 진행해본 결과, random하게 pick한 400 개의 colony 중에서 3개에서만 colony PCR인 진행되었습니다.
Vector prep을 하였을 때는 모두 vector는 존재하였지만, size나 sequencing을 하였을 때 insert가 전부 없던지, insert 포함 앞 뒤로 조금씩 비어있는 결과가 확인되었습니다.
이러한 현상으로 인하여 모든 실험이 멈춰져 있는 상태입니다..
저와 같은 경험이 있으시거나, 원인 또는 해결 방안을 알고계시는 분이 계시면 답변 부탁드리겠습니다.
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