실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
western blot stripping 질문드립니다 ㅠㅠ
레벨5 시은 (대학원생)
현재 WB을 진행중이 석사과정생입니다
최근에 자주 WB일이 생겨서 진행중인데요
원래는 stripping을 보통 다시 진행했었던 경우가 드물고 했었던 학생들이 예전에 졸업해서 방법이나 트러블슈팅들을 알아보고 있는 중입니다.
질문드리고 싶은 것은 제가 정리한 과정이 맞는지나 따로 몇가지 추가로 여쭤보고싶은게 있어서 이렇게 글을 쓰게 되었습니다.
먼저 제가 정리한 stripping 과정은 이렇습니다.
stripping buffer제작
100ml기준
20ml 10%SDS, 12.5ml 0.5M Tris-HCl PH 6.8, 사용 직접0.8ml beta-mercaptoethanol
이후 미리 버퍼 50도에서 워밍후 membarane에 부어 50도에서 45분간 stripping
이후 TBST에 담그어 RT 10분간 워싱 4번진행 후 Blocking진행
이렇게 진행하고자 하는데 문제가 없을까요?
그리고 제가 추가로 여쭤보고 싶은 부분은 stripping전에 시간이 없어서 일단 감광 끝나고 tbst에 담그어 냉장고에 보관해 뒀었는데 일주일정도 지나니 감강이 되었던 밴드 부분에 회색? 검정색의 자국이 남아있었습니다. 혹시 stripping해서 다시 사용하는데는 문제가 없을까요?
또 이전에 비슷한 과정으로 진행했었던 적이 있었는데 ECL용액을 부어 감광시에 membrane이 전체적으로 빛나는 경우가 발생한 적이 있었습니다. 혹시 이런 왜 그런걸까요? stripping이후에 워싱이 부족해서 발생하는 경우 인가요?
고수님들의 답변 기다리겠습니다 감사합니다 ㅠㅠ
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