실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
한달째,,수득률계산하기---
레벨4 초보석사쌤 (대학생)
안녕하세요 선생님들,, 저는 한달째 수득률 구하는 것 때문에 고민이 많습니다.
계속 다른 방법으로 해보아도 계산이 안되고 어디가 잘 못된지 이해를 못하겠어서 이렇게 글을 남깁니다.
우선 저의 실험 방법은 다음과 같습니다. construct은 A와 B가 C에 의해 연결되어 있습니다. C를 cut하여 순수한 B를 얻는것이 목적입니다.
A는 15kDa이고 B는 7kDa 정도로 A+B는 23kDa정도 입니다. 이 단백질을 culture하여 14.3mg/L의 수득률을 구 할 수 있었습니다. C를 cut하기 위해서는 furin enzyme를 이용합니다.
이때 furin digestion condistion은 fusion protein 25ug에 total 25ul로 digestion condistion buffer로 채워 16H동안 digestion해줍니다. A+B = 2.2mg/mL 입니다. 이는 곧 2.2ug/ul라서 25ug을 만들기 위해서 11.2ul(protein)+1ul(furin enzyme)+12.8ul(DW)를 넣고 digestion했습니다. 이때의 갯수는 20개씩 하여서 final total은 500ul로 맞추었습니다.
SDS 상으로는 잘 digestion되었고 A를 제거 후 7kDa인 B를 구하기 위해서 3K filter를 이용하여 농축과 동시에 purify하였습니다. 최종으로 얻은 양은 1.287ug/ul를 얻었습니다. 총 100ul이기에 1.28*100 = 128ug이며, mole로 환산시 (128/1000000)*7 이므로 대략 17nmole이 나옵니다
***1. 맨처음 A+B는 23kDa을 culture하여 14.3mg/L를 얻었을때 B를 얼마나 얻을 수 있는지 알고 싶습니다.
2. 맨처음 11.2ug 씩 20개를 했을때, 대략 498ug을 제가 넣은건데 498ug에서 B의양을 알고 싶어서 (498/23(A+BkDa))*7이 15ug의 B의 양이 존재한다고 가정할 때 제가 purify후에 100ul를 얻어서 1.2ug *100 =128ug을 얻었는데 이럴수가 있나요,,,
digestion 하지 않은 A+B일때의 B의 양과 최종적으로 purify했을때의 B의 양이 비교하여 수득률을 얻고 싶습니다....양과 mole 두가지 방법으로 모두 비교해보고 싶습니다.
한달째 계산 만하고 있는데 어디서 부터 잘 못된건지 ,,,, 정말 모르겟습니다....선생님들 제발 같이 처음부터 알려주는 것 처럼 알려주시면 안될까요? 이렇게 바꾸세요 저렇게 고치세요 보다 같이 해설하면서 풀어주셨으면 좋겠습니다,, 제가 이해 할 수 있도록 제발 부탁드립니다,,,,,,같이 해설 해주시면 정말 감사하겠습니다.
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