1. ponceau s 염색을 통해 단백질이 잘 넘어갔는지 확인해주세요.
2. 1차 및 2차 항체를 어느정도 농도로 넣었는지 같이 알려주면 좋을것 같아요. (host도 확인해보세요)
3. 2차 항체에 HRP 붙은것을 사용했는지, ECL activity가 떨어지지 않았는지 확인해보세요.
다른 연구원들이 진행하는 다른 타겟도 잘 안나온다면 transfer가 잘 안되는게 아닌가 싶습니다. 또는 ECL이 문제거나~
경험상 예전 어떤 연구원이 ECL a와 b solution을 한개의 팁으로 그냥 섞어썼다가 activity가 떨어져서 모두 데이터가 안나왔던 공포스러운 기억이 나네요 ㄷㄷ
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레벨5
동물사랑 *^^*
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20.06.04 20:37
애초에 단백질양과 SB 시약 디자인을 잘못 하신 건지 생각해 보세요. 트랜스퍼 몇 볼트로 몇 시간 하는지요?
우선 JNK는... 일종의 홍길동 같습니다...
특히나 확실한 조건이 잡히지 않는 상황에서는....
가장 먼저, actin 등 다른 것을 확인을 동시에 해보셔야 할 것 같습니다.
Detection buffer의 문제인지 아닌지를 파악 하셔야하고,
가능 하시다면, marker를 활용하시면 좋습니다.
특정 marker는 특정 antibody (actin or histidine)에 반응하여 확인이 가능합니다.
이 경우에는 antibody 등 전반적인 시약들을 확인하는 것으로
sampling에서의 문제로 생각 할 수 있을 것입니다.
Transfer에 문제가 없을 것 같다 하셨지만, 그래도
ponceau stain등을 활용하여 확인을 해보시는 것도 좋을 것 같습니다.
다 잘나오고, 선생님만 안 나오는건지,
최근에 잘 안 나온다는 것은 위 사진처럼 아예 안 나오는 것인지를
모르기 때문에 정확히는 파악하기 힘들 것 같습니다.
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레벨1
crispbac
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20.06.07 04:51
이정도로 band가 안나오는건 실험 테크닉의 문제보다는 ECL이나 secondary antibody에 문제가 있는것 같습니다.
GAPDH나 alpha tubulin 같은 maker protein 확인해보시고 이것들도 WB로 확인이 안된다면 ECL이나 secondary antibody를 새로 사서 실험해보세요.
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레벨3
더잘하고싶다
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20.06.07 18:19
흔히 있는 일인데 일단 벌어지면 골 때리는 일이지요.. 저도 학위 과정 중에 저런 일을 겪었었는데 제가 겪었던 유형은..
1. Lysis buffer가 맛이 감
2. buffer pH의 문제
3. ECL 솔루션 맛이 감
4. transfer buffer에 과량의 누군가 SDS를 넣었는데(넣는 프로토콜 있음) 넣는 것도 모잘라 용량 계산을 잘못해 10배 더 넣었고, 멤브레인에서 꺠끗하게 wash out~~~
5. TBS-T에 마찬가지로 tween 대신에 triton을 그것도10 배 떄려넣기..
등등 공용 시약 등 쓰다보면 별의별 상상도 못할 일들이 터집니다.. 실험실에 있는 tris glycine 등을 이용해서 본인만의 버퍼를 만들고 처음부터 해보세요. 그래서 결과가 잘 나오면 어딘가 범인이 숨어있는 겁니다.