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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 Solube insolube 확인
알202020(대학생)  | 06.03 23:17
첨부파일 파일첨부: 112.JPG (36 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요? Preotein solube insolube 확인하는 실험을 진행중입니다.

왼쪽 첫번째사진이 쿠마시블루로 찍은 사진입니다. 빨간 네모칸이 목적 단백질입니다. NI(Induction 전), I(Induction 후), A(Lysis후 Sonication해서 얻은 Sup), B(Sup제거후 밑에 pellet을 다시 Lysis buffer넣고 resuspend시킨 sample)입니다. 쿠마시블루로 확인이 힘들어 두번째와 세번째사진은 W.B으로 찍은사진입니다. A,B부분을 보면 2개 line모두 항체에 찍혀나오는데 이런경우는 단백질이 solube로 간건지insolube로 간건지 판단이 안섭니다. 마지막 사진은 두번째사진과 다른 Lysis buffer를 사용하여 Sup만 W.B 찍어본 사진입니다. W.B으로 찍은사진을 보면 NI부분에는 단백질발현이 되지않아 항체에 찍힌 Iline없고 I후에 사진이 찍히는 거보면 IPTG 발현은 되는거같은데. Solube인지 insolube인지 모르겠습니다.어떻게 해석해야할까요??

#protein
 
#solube
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  06.04 09:55  

wild type은 대부분 soluble로 나오지만 재조합의 경우 100% insoluble, soluble로

나오는 경우는 많지 않고 두 fraction이 % 별로 나누어집니다.

맨오른쪽 결과를 보면 왼쪽 lane은 I가 오른쪽 lane은 IA가 많습니다.

모두 같은 시료라면 발현문제라기 보다 lysis 문제같습니다.

lysis 조건을 한번 더 검토해 보는 건 어떻습니까?

알202020  |  06.04 11:05  
세번째 사진 왼쪽라인과 오른쪽라인 IPTG양이 다른 조건에서 내려본 사진입니다. SOLUBE INSOLUBE 를 확인할때 A B 를 비교해서 확인하는게 아닌가요?? I랑 A를 비교해서 INSOLUBE SOLUBE 여부를 판단할수있는건가요?? 가운데사진이 lysis가 좀더 오른쪽 마지막 사진보다 강한 lysis buffer를 사용했습니다
개구리금강상품권  |  06.04 11:08  
대부분 insoluble protein은
aggregation form 입니다
또한 과발현 중 cleavage 되어 insoluble body로 떨어지기도 합니다

그래서 어떠한 lysis buffer를 사용하신건지는 모르나,
한번 aggregation 된 protein은 쉽게 linear form으로 되지 않습니다.
확실한 확인을 원하시면 urea buffer를 추천드립니다

현재의 정보로는 insoluble 인지 아닌지, 왜 그러한지 알기 어렵네요,,
알202020  |  06.04 11:21  
Sonication을 하는경우 1xPBS로만 resuspend시켜도 충분하다고 해서 1XPBS를 이용해서 다시 해보려하는데Lysis buffer가 큰영향을 미칠까요?? Solube insolube 확인을 하려면 A쪽에만 항체에 찍히고 B쪽에는 안찍혀야 SOLUBE PROTEIN으로 해석할수 있나요??
가운데 사진은 RIPA buffer 를사용했습니다
개구리금강상품권  |  06.04 11:31  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
예 큰 영향을 미칠 수도 있습니다.

보통 sonication 시에는 PBS로 충분하지만,
scale에 따라 lysozyme등등이 필요하기도 합니다.

하지만 small sacle의 경우,
PBS로 lysis후 다운시켜 sup은 그대로 SDS smaple buffer 넣어 sampling을 하고, pellet은 lysis 또는 urea buffer에 녹여 sampling합니다. 이론으론 rifa도 다 되지만, 경험적으로는 urea가 확실합니다. (urea 넣고 다시 sonication을 추천합니다.)
알202020  |  06.04 11:39  
A (PBS로 resuspend 한뒤 sonication 후 센트리 돌린 sup), B(sup제거후 pellet을 다시 ureabuffer로 resuspend시킨 sample) 이렇게 A B 를 내려보라는 건가요?? Solube 양상을 보인다면, A쪽 sample라인에만 항체가 찍혀야하는건가요?? 사진을 찍었을경우 어떤 양상을 보여야하나요??
개구리금강상품권  |  06.04 11:41  
A, B로 lane을 따로 내리시면 됩니다. 위의 중간 사진처럼..
현재는 insoluble하게 보이지만,
윗분들의 말씀처럼 lysis가 문제인지
실험 기법의 문제인지 알기엔 정보가 부족합니다,,,
알202020  |  06.04 11:46  
어렵네요 전 가운데 사진 A B 모두 항체에 찍혀 반은 solube 반은 insolube 로 발현되는 줄알았는데 아닌가보네요 ㅠㅠ
대왕개구리SPEED  |  06.04 12:36  

lysis 조건을 다시 확인해 보는 것이 좋을 듯 합니다.

sample간 lane 붙이지 말고 확인해 보세요.

50 : 50은 나올 것 같습니다. 

개구리금강상품권  |  06.04 12:39  
네. 쉽지 않습니다. 동일하게 형질전환을 했어도,
경향성, 활성도도 너무 다릅니다.
10개의 single colony를 확인한 적이 있는데,
그 중 한개만이 발현이 되기도 했었죠....
알202020  |  06.04 17:19  
네 조언해주신 방법으로 다시 해보겠습니다
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