qPCR돌릴 cDNA의 농도는 확인해보셨나요?
샘플들의 농도를 맞춰서 돌렸는데도 들쭉날쭉이면
다른 gene을 ref로 쓰셔야겠는데요
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BlackSmile
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20.06.03 18:08
위의 분에 말씀해주신대로,
합성한 cDNA의 농도는 sample별로 비슷한지 우선 확인이 필요합니다.
그리고, housekeeping gene의 경우 cell line나 tissue organ의 종류에 따라 사용할 수 있는 target gene이 약간씩 다릅니다.
저같은 경우에는 GAPDH, Tubulin, beta-actin 유전자에 대한 primer만 이용해서 분석할 sample로 qPCR을 진행하고, 그 중에서 sample별로 고르게 expression하는 target gene을 선정하여 실험을 진행하는 편입니다.
다른 샘플에서 제작한 cDNA라면 house-keeping 유전자라할지라도 발현값이 다른 것이 당연합니다. 특히 RNA 추출정제과정에서 대부분의 실험오차가 생깁니다. 이런 실험에 익숙해지면 나아집니다.
Realtime PCR에서 표준적으로 사용하는 상대정량방법은 이런 차이를 보정하는 계산식이 들어있기 때문에 큰 문제가 되지 않습니다. 그런데, 산술적인 보정이 유효한 차이의 범위가 있기 때문에, 윗분이나 윗윗분의 지적처럼 cDNA 농도를 어느정도 (딱부러지는 기준은 없지만, house-keeping 유전자의 Ct값이 20이내가 되도록 높게, 그렇지만 15이상은 되도록) 적당히 조절하는 것이 일반적입니다.
이 조건은 Realtime PCR 시약을 소모하지 않고도 잡을 수 있는데, 우선 Ct값이 15~20 으로 나온 샘플을 기준으로, 일반 PCR을 돌리고 아가로스젤에 전기영동한 후 밴드의 굵기를 보면서 cDNA 농도를 조절하면 됩니다. 한번에 맞추지 못하면, 다시 조정해면 됩니다. 이게 semi-quantitative RT-PCR 기법이죠. 이제 Realtime-PCR을 돌리면 됩니다.
샘플을 반복 개념(biological replication)으로 사용하신 듯 한데, 기술적 반복(technical repl.)이 꼭 필요합니다. 샘플마다 최소 2~3 반복을 해야 나중에 통계처리에서 유리합니다.
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클레엉
(대학원생)
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20.06.04 14:50
세분 선생님 조언 감사합니다.
한번 말씀하신 부분 진행해보겠습니다.
그리고 느림보 선생님, 제가 원하는게 그것입니다ㅠㅠ 교수님께서 15앞뒤에서 house keeping gene 이 나와줘야하는데 왜 저렇게 고르지 못하냐하시더라구요. 제가 차라리 뭐 샘플 세트의 Ct 값이 20 21 20 22 20 20 이러면 mRNA 퀄리티가 안좋거나 한가보다 하겠는데... 저렇게 중구난방이니(한번에 뽑았는데도요..) 뭐가 문제인지 혼란이 왔습니다ㅠ
그리고 혹시 cDNA 를 합성할 때 mRNA denaturation (72도, 5~10분) 을 꼭 해줘야하나요? 키트에서는 언급이 안되어있는데 구글링을 하다보니 위 스텝이 적힌 경우가 있어서 궁금해서 여쭙습니다.
저는 65도에서 5분 해주고 있습니다
gDNA remover가 포함된 kit을 쓰시나요?
아니라면 primer 설계나 (단일 exon내 증폭)
qPCR전에 같은 조건으로 PCR 돌리고
agarose gel에 내려서 원하지 않는 사이즈의 밴드가 나오는 지 확인 등
gDNA contam 가능성도 한 번 검토해보세요.
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레벨5
클레엉
(대학원생)
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20.06.04 18:17
제가 아는 바로는 gDNA remover 는 따로 들어있지 않은걸로 알고 있습니다ㅠㅠ
혹시 precipitation/washing step 에 centrifuge 속도가 어떻게 되나요?
이를 확 낮추세요.
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94111810@naver.com
(비회원)
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20.06.05 10:07
RNA 뽑고 정량은하시고 RT하시죠???
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레벨5
클레엉
(대학원생)
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20.06.05 10:53
12000rpm, 10분으로 하고 있습니다.
예 정량하고 있습니다.
Trizol manual은 12000g, 10min 입니다
Rotor 크기에 따라 12000rpm이랑 12000g 차이가 많이 나니
rpm to g 변환해서 확인 다시 한 번 해보세요.
wash step 7000-7500g 로 해보세요.
12000g/12000rpm 는 좀 셉니다.
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피자도우
(비회원)
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20.06.08 13:46
저희 랩에서는 house keeping gene의 ct 값이 다를시 cDNA를 희석해서
house keeping gene 보정을 한 후 실험을 진행합니다.
보통 수치가 1차이나면 2배 희석하여 비슷한 수준으로 맞춰
타겟을 반복합니다.
희석할때 버퍼는 DNA kit에 elution buffer를 쓰는게 제일 안정적인것 같고요
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지나가다..
(비회원)
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20.06.08 17:31
답변들이 다들 이상한 곳을 향해잇네요.
House Keeping gene level이 다르다는 것인데 RNA 추출을 제대로 하라니.. 이건 좀 아닌거 같네요.
RNA 추출 후 정량했을때 purity가 높은지 낮은지, integrity가 높은지 낮은지 정도를 봐야지 추출 방식을 보면 뭐할까요? 해당 수치 들이 낮으면 그때서야 추출방식을 봐야하는게 맞지 않을까요?
CT값에 변동이 생기는 이유는
- 기본적으로 pipeting 문제 : 해당 부분에 대해 자신있으신가요?
- cDNA or RNA inhibitor 포함 문제 : sample내 inhibitor가 포함된다면 CT값이 들쭉 날쭉 합니다. 기본적으로 RNA purity를 체크..
- Enzyme의 활성 저하 : 잘못된 보관 방법으로 인한 활성 저하 (역전사효소, qPCR master mix 둘다 체크 필요)
: 엔자임 활성은 같은 샘플을 같은 primer로 했을때 CT값의 차이가 많이 발생합니다. 즉 표준편차가 높습니다.
- cDNA 합성시 사용하는 Primer 종류? Oligo dT 사용시, Primer 위치에 따라 효율편차 발생이 심함.
cDNA 합성시, RNA를 고온에 노출시키는 것은 RNA 고차구조를 풀어주기 위함인데, 일부 제품에서는 해당 과정이 생략되는 경우가 많고, Random primer 사용하면 굳이 해당 스텝 없어도 결과 잘나옵니다. 보통 Full length cDNA 합성할때 해당 방식을 쓰는거죠..
추가적으로 gDNA 오염일 경우 melting curve에서 확인 가능합니다. Melting curve도 체크하셨나요?