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질문 HMC-1셀에 PMA처리 결과좀 discussion 부탁드립니다!
올챙이얗후(일반인)  | 06.03 10:27

안녕하세요 생리활성쪽으로 연구하는 직장인입니다.

 

지금 현재 진행하는 실험이 HMC-1 셀에 PMA/A23187을 이용하여 염증을 유발 후 샘플처리하여 효능을 보고있습니다.

대략적으로 프로토콜을 설명하겠습니다.

96 well plate에 1×104 cells/well 로 분주하였고,

30분 뒤 PMA (50nM), A23187 (1μM)를 처리 하고 시료를 처리한 후,

6시간, 12시간 24시간 뒤, 세포를 센트리퓨즈로 돌려 가라앉게 한 후, 배양 상층액을 수거했습니다. 


그 후 1차 항체 coating plate를 다음날, 3번 wash buffer로 세척 후,
Assay buffer를 200μL 분주하였고, 1시간 뒤 3번 세척하였습니다.

sample과 standard를 100μL 분주 후, 2시간 실온 상태로 두었고 5번 세척하고, working Detector (2차 항체 +SA-HRP) 100μL 분주 후, 1시간 실온 상태로 두었습니다.


세척 후, Substrate Solution을 100μL 분주하고, 암실에서 최대 30분 놓고. 마지막으로, Stop Solution (1M H₃PO₄)을 50μL 분주한 후, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다.

실험방법은 다음과 같은데 결과를 보면 무처리구인 control과 PMA/A23187처리한 negative control과 차이도 없고 당연히 샘플처리한 구간도 차이가 없었습니다. ㅜㅜ

도대체 어느부분에서 미스가 있었을까요?

 

시약이 문제있을까 새로구입해서 진행하고 있고 셀 농도도 조절하고있습니다. 거기서는 문제가 될거같지 않고요. 

PMA/A23187 농도도 저정도면 충분하다 하여서 저대로 진행하고있습니다.

혹시 관련 실험에서 견해있으신분 피드백 부탁드립니다 !

 

#HMC-1
 
#PMA
 
#A23187
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  06.03 10:44  

측정 지표가 어떤 물질이고 해당 물질의 Ab를 직접 coating해서 사용하나요?

직접 coating한 Ab로 STD curve는 정상적으로 나옵니까?

올챙이얗후  |  06.20 13:47  
측정 지표 물질은 tslp이고

결과가 안나와서 시간별로
Pma 농도별로 해보고있는데도
안되네요
왜그럴까요ㅜㅜ
대왕개구리SPEED  |  06.20 15:22  

초기 cell 수를 3~5 x 10^5 정도로 올리면 좋을 것 같습니다.

보통 PMA + A23187을 처리 후 5 ~ 7시간 정도면 차이가 나기 시작합니다.

ELISA 방법 문제는 없나요?

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