실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
BCA Assay 계산식이 이해가 되지 않습니다..
레벨5 VForen (대학원생)
안녕하세요 실험적으로 초보인 대학원생입니다.
현재 thermo 사의 BCA Assay kit를 사용하고 있습니다.
계산은 실험실에서 엑셀 시트를 주셔서 하고 있는데
계산식이 도저히 이해가 되지 않아 여기에 여쭤봅니다..
만약에 스탠다드 곡선 식이 y=ax - b 라고 치면
1. Net 값이 OD-Blank(스탠다드의 블랭크 OD값) 인데 이 때 Net값이라는게 무엇인지요? net값을 아무리 쳐봐도 나오지가 않습니다...
2. (Net-b)/a -> 이 값은 브릭에서 찾아보니 샘플의 OD값을 Y라고 했을 때 X값이 단백질 농도라고 하는데 사실 이것도 이해가 안가지만... 가장 이해가 안되는 것은 어찌됐건 제가 알고 싶은건 샘플 내에 포함 된 단백질 농도인데
이 (Net-b)/a 값을 10으로 나눈게 ug/ul 라고 합니다.
하지만 제가 bca assay를 할 때 분주하는 것은 샘플에서 protein을 추출한 뒤 1:100으로 희석하여 25ul를 분주하는데 왜 25로 나누지 않고, 10으로 나누는 것인지? 이해가 되지 않습니다..
그리고 이러한 계산식을 통해 나오는 값이 만약 40ug/ul 라고 가정한다면,
제가 1:100 희석을 했으니 희석전 샘플의 단백질 농도를 알고 싶으면 x100을 해야하는 것 아니냐고 여쭤보니 굳이 100을 곱할 필요가 없고 40ug/ul가 희석전 샘플의 단백질 농도라고 합니다.
이유는 엑셀시트에서 자동으로 보정이 되는것이라고 하는데 블럭을 눌러보면 계산식은 위에 제가 써둔 식입니다... protein 농도를 정확히 알아야 다음 실험으로 넘어가는데 너무 혼란스럽습니다 ㅠㅠ
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