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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 BCA Assay 계산식이 이해가 되지 않습니다..
올챙이VForen(대학원생)  | 06.01 09:50

안녕하세요 실험적으로 초보인 대학원생입니다.

현재 thermo 사의 BCA Assay kit를 사용하고 있습니다.

계산은 실험실에서 엑셀 시트를 주셔서 하고 있는데 

계산식이 도저히 이해가 되지 않아 여기에 여쭤봅니다..

 

만약에 스탠다드 곡선 식이 y=ax - b 라고 치면 

1. Net 값이 OD-Blank(스탠다드의 블랭크 OD값) 인데 이 때 Net값이라는게 무엇인지요? net값을 아무리 쳐봐도 나오지가 않습니다...

2. (Net-b)/a -> 이 값은 브릭에서 찾아보니 샘플의 OD값을 Y라고 했을 때 X값이 단백질 농도라고 하는데 사실 이것도 이해가 안가지만... 가장 이해가 안되는 것은 어찌됐건 제가 알고 싶은건 샘플 내에 포함 된 단백질 농도인데

이 (Net-b)/a 값을 10으로 나눈게 ug/ul 라고 합니다. 

하지만 제가 bca assay를 할 때 분주하는 것은 샘플에서 protein을 추출한 뒤 1:100으로 희석하여 25ul를 분주하는데 왜 25로 나누지 않고, 10으로 나누는 것인지? 이해가 되지 않습니다..

그리고 이러한 계산식을 통해 나오는 값이 만약 40ug/ul 라고 가정한다면,

제가 1:100 희석을 했으니 희석전 샘플의 단백질 농도를 알고 싶으면 x100을 해야하는 것 아니냐고 여쭤보니 굳이 100을 곱할 필요가 없고 40ug/ul가 희석전 샘플의 단백질 농도라고 합니다. 

이유는 엑셀시트에서 자동으로 보정이 되는것이라고 하는데 블럭을 눌러보면 계산식은 위에 제가 써둔 식입니다...  protein 농도를 정확히 알아야 다음 실험으로 넘어가는데 너무 혼란스럽습니다 ㅠㅠ 

#BCA
 
#Protein
 
#Concentration
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이이예이  |  06.04 07:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

blank subtraction: plastic ware 또는 sample을 dilution 한 buffer 등에 의한 흡광을 제거해주기 위해서 sample의 OD에서 Blank OD를 빼주어야합니다. 이게 님이 말하시는 Net 값인 것 같네요.

 

농도를 알고있는 BSA를 standard로 하여 serial dilution 한 다음 각 농도별 OD 값을 측정합니다. 주로 2mg/ml로 시작하여 2-fold dilution을 하거나, 님이 사용하시는 kit의 instrcution에 따라 희석하시면 됩니다. standard의 알고 있는 농도와 측정 OD값을 가지고 y축은 OD값, X축은 protein conc. 로 하여 standard curve를 그리면, linear 형태가 될 것이며 그 그래프의 수식을 y=ax+b 로 한다면 sample의 농도는 (Y-b)/a로 계산 할 수있습니다. (X 축이 protein conc. 로 모르는 값, Y축이 OD값-측정 값이기 때문에, 수식에서 y에 OD를 대입해주어야 합니다)

10으로 나누는 것은 위의 설명만으로는 정확히 파악하기 어렵겠지만 standard와 sample의 단위차이때문에 그렇게 해주는 것 같네요.

standard와 sample 모두 25 ul씩 loading 하였기 때문에, loading 한 volume이 동일한 경우 25 loading volume은 무시하셔도 됩니다. 다만,  sample을 100배 dilution 하여 BCA assay를 하셨다면, sample 원액의 농도는 dilution factor를 곱해주어야 합니다. 

 

 

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