실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Transformation
Transformation 결과로 Blue/White selection을 했는데 결과에 대해 질문이 있습니다.
레벨1 hoit (대학생)
학교에서 Transformation 결과로 Blue/White selection을 진행했습니다. 방법은 아래와 같았는데 결과가 예상과는 너무 다르게 나왔습니다.
실험에서 사용한 플라스미드는 가장 보편적인 '엠피실린 저항성 유전자-lac Z 유전자를 가진 플라스미드'였습니다.
- 실험방법 -
1. Competent cell (100ul)에 plasmid 10ul을 모두 넣고 Ice에 15분간 둔다.
2. Heat shock : 42'C water bath에 90초간 두고 다시 Ice에 5분간 둔다.
3. IPTG (10ul), X-gal (40ul)을 ampicillin plate에 떨어뜨리고 도말한 후 만들어놓았던 comcell 60-70ul을 plate에 도말한다.
4. 37'C 배양기에 12시간 이상 둔다.
- 실험결과 -
IPTG는 lactose 유사체로 repressor protein이 IPTG와 결합하게 되면서 lac Z 유전자가 전사되어 beta-galactosidase가 발현되도록 해준다고 알고 있습니다. 또한 X-gal은 beta-galactosidase에 의해 분해되어 파란염료를 내게 되구요.
Transformation의 결과로 생길 수 있는 cell의 종류는 세 가지로,
1. 목적 유전자가 삽입되어 ampicillin 저항성은 지니지만, lac Z 유전자가 불활성된 plasmid를 가진 cell (배지에서 흰색 colony 형성)
2. 1번과 같은 목적 유전자가 들어가있지 않고 lac Z, ampicillin 저항성 유전자가 모두 활성화된 plasmid를 가진 cell (배지에서 푸른색 colony 형성)
3. 어떠한 plasmid도 가지지 않은 cell (배지에서 사멸되어 관찰 X)
이렇게 나온다고 예상을 했습니다.
즉 실험결과에서 나타난 colony들은 1번에 해당하는 것으로, 실험과정에서 목적 plasmid가 잘 삽입되어진 colony라고 볼 수 있습니다. Lactose가 따로 들어가있지 않은 상태에서 IPTG가 제역할을 잘 수행했기에 이러한 colony가 형성될 수 있었을 것이고, 실험과정을 다시 돌아보더라도 com cell에 목적 plasmid가 잘 들어갔기 때문에 별다른 문제점이 없는 듯했습니다.
제가 궁금한 점은 총 세 가지 입니다.
1. Colony가 왜 이렇게 적게 나왔는가?
2. 왜 푸른색을 띠는 colony들이 형성되지 않았는가?
3. 어떤 점을 개선해야 실험이 더 성공적(colony 수가 많아지고 흰색, 푸른색 colony 모두가 나타나도록)으로 이루어질 수 있을까?
모두 다 생각해봤지만 아직 배움이 부족해서인지 모르는 부분이 많아 질문을 올립니다. 가르쳐 주신다면 부족한 부분을 잘 메워서 앞으로 공부하는 데에 큰 보탬이 될 것 같습니다. 감사합니다.
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