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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 Transformation 결과로 Blue/White selection을 했는데 결과에 대해 질문이 있습니다.
알hoit(대학생)  | 05.30 11:03

   학교에서 Transformation 결과로 Blue/White selection을 진행했습니다. 방법은 아래와 같았는데 결과가 예상과는 너무 다르게 나왔습니다.

   실험에서 사용한 플라스미드는 가장 보편적인 '엠피실린 저항성 유전자-lac Z 유전자를 가진 플라스미드'였습니다.

- 실험방법 -

1. Competent cell (100ul)에 plasmid 10ul을 모두 넣고 Ice에 15분간 둔다.

2. Heat shock : 42'C water bath에 90초간 두고 다시 Ice에 5분간 둔다.

3. IPTG (10ul), X-gal (40ul)을 ampicillin plate에 떨어뜨리고 도말한 후 만들어놓았던 comcell 60-70ul을 plate에 도말한다.

4. 37'C 배양기에 12시간 이상 둔다.

 

- 실험결과 -

upload_image
       
              < 보시다시피 흰색 콜로니만 극소수 생겨났습니다. >
   제가 실험한 결과를 나타낸 사진으로, 플라스틱 막대를 사용하여 도말하였기 때문에 배지에 스크래치가 생겼습니다.
​​​​
upload_image

         < 똑같은 배지에 같은 실험방법으로 재실험을
            진행했을 때 나온 올바른 결과 사진입니다.>

 

   IPTG는 lactose 유사체로 repressor protein이 IPTG와 결합하게 되면서 lac Z 유전자가 전사되어 beta-galactosidase가 발현되도록 해준다고 알고 있습니다. 또한 X-gal은 beta-galactosidase에 의해 분해되어 파란염료를 내게 되구요. 

Transformation의 결과로 생길 수 있는 cell의 종류는 세 가지로, 

1. 목적 유전자가 삽입되어 ampicillin 저항성은 지니지만, lac Z 유전자가 불활성된 plasmid를 가진 cell (배지에서 흰색 colony 형성)

2. 1번과 같은 목적 유전자가 들어가있지 않고 lac Z, ampicillin 저항성 유전자가 모두 활성화된 plasmid를 가진 cell (배지에서 푸른색 colony 형성)

3. 어떠한 plasmid도 가지지 않은 cell (배지에서 사멸되어 관찰 X)

이렇게 나온다고 예상을 했습니다.

즉 실험결과에서 나타난 colony들은 1번에 해당하는 것으로, 실험과정에서 목적 plasmid가 잘 삽입되어진 colony라고 볼 수 있습니다. Lactose가 따로 들어가있지 않은 상태에서 IPTG가 제역할을 잘 수행했기에 이러한 colony가 형성될 수 있었을 것이고, 실험과정을 다시 돌아보더라도 com cell에 목적 plasmid가 잘 들어갔기 때문에 별다른 문제점이 없는 듯했습니다.

 

   제가 궁금한 점은 총 세 가지 입니다. 

1. Colony가 왜 이렇게 적게 나왔는가?

2. 왜 푸른색을 띠는 colony들이 형성되지 않았는가?

3. 어떤 점을 개선해야 실험이 더 성공적(colony 수가 많아지고 흰색, 푸른색 colony 모두가 나타나도록)으로 이루어질 수 있을까?

 

모두 다 생각해봤지만 아직 배움이 부족해서인지 모르는 부분이 많아 질문을 올립니다. 가르쳐 주신다면 부족한 부분을 잘 메워서 앞으로 공부하는 데에 큰 보탬이 될 것 같습니다. 감사합니다.

 

#Transformation
 
#Blue/White selection
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  05.30 12:06  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 사용한 plasmid가 lacZ에 insert를 ligation한 plasmid인가요?

2. ligation도 수업 시간에 학생들이 했나요?

3. colony가 적게 나온것은 여러 이유가 있습니다.

plasmid 양이 적은 경우, CP cell 효율이 낮은 경우, TF 방법에 문제가 있는

경우 등.

질문에 있는 TF 방법에서 plasmid를 CP cell과 잘 혼합을 안한것 같고

heat shock 후 recovery 시간이 없는 것 같습니다.

4. blue colony가 안나온 것은 전체 colony가 적게 나왔기 때문에 TF 효율이

정상적으로 나와야 알수 있을 것 같습니다.

5. 3번 TF 과정을 원래 방법으로 하면 colony가 많이 나올겁니다.

재실험 했을 때 plate에 많이 나왔기 때문에 CP cell, plasmid 양은 문제가

없을 것 같습니다.

 

알hoit  |  05.30 14:56  

먼저, 답변해주셔서 감사하다는 말씀 드립니다.

1. 사용한 plasmid는 lac Z 부분에 insert를 ligation한 것이 맞습니다.

2. Ligation은 제가 진행하지 않고 이미 조교분들께서 만들어놓으신 plasmid를 com cell에 넣는, 윗글에 적힌 작업만 시행했습니다. 

Colony가 적게 나오는 이유에 대해 말씀을 해주셨는데, CP cell 효율, TF 방법, TF 효율 등에 대해서 설명을 좀 부탁드려도 될까요? 부족한 부분이 많아 죄송합니다.

이론상으로 보면 insert plasmid, 일반 plasmid 두 가지를 혼합해서 com cell에 넣고 heat shock을 하는데 혹시 plasmid 용액 제작에 있어 insert DNA가 들어간 plasmid만 넣는 착오가 있었을 가능성도 배제할 수 없지 않나요?

감사합니다.

 

대왕개구리SPEED  |  05.30 15:24  

- 이론상으로 보면 insert plasmid, 일반 plasmid 두 가지를 혼합해서 com cell에 넣고

heat shock을 하는데 혹시 plasmid 용액 제작에 있어 insert DNA가 들어간 plasmid만

넣는 착오가 있었을 가능성도 배제할 수 없지 않나요?

: ligation을 해도 100% ligation이 되지 않기 때문에 insert 없는 plasmid를 넣지

않아도 blue, wite colny가 동시에 나옵니다.

단지 white colony 수가 많이 나옵니다.

그리고 일반적으로 ligation plasmid + empty plasmid를 혼합해서 실험하지는

않습니다.

알hoit  |  05.30 18:47  

보통 comcell과 plasmid를 혼합하여 얼음에 30분을 두던데 제 실험에서는 15분 정도밖에 두지 않았습니다. 그렇기에 plasmid가 comcell 표면에 붙을 충분한 시간이 주어지지 않았고 그에 따라 colony의 수가 적게 나왔을 가능성도 있을까요??

대왕개구리SPEED  |  05.30 18:55  

오래 ice에 보관한다고 좋은 것은 아닙니다.

CP cell + plasmid를 혼합한 후 ice에 넣는 것은 cell과 DNA의 접촉 시간과

heat shock을 줄 때 온도 차이를 많이 나게 하려고 하는 것입니다.

CP cell + plasmid의 부피가 작기 때문에 15분이나 30분이나 온도가 동일하게

내려갈겁니다.

15분 보다는 30분이 나을 것 같은데 그리 많은 colony차이는 나지 않을 겁니다.

 

 

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