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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 overlap pcr primer 질문드립니다.
알한파인(대학생)  | 05.29 19:14

두 유전자를 연결하기 위해 overlapping PCR을 수행하려고 primer를 디자인하고 있습니다. 

제가 짠 프라이머는 아래와 같은데

F overlap primer: ctc cca ata aag act tct ttt cct gat gga gag ttt a

R overlap primer: t aaa ctc tcc atc agg aaa aga agt ctt tat tgg gag

 

1. 위의 F overlap Primer에서 밑줄치지 않은 부분은 앞쪽 유전자의 3' 말단부분이고 밑줄친 부분은 뒤쪽 유전자의 5' 말단부분입니다. overlap PCR의 프라이머는 이렇게 디자인하는 것이 맞나요? 

 그리고 Tm값을 계산할 때 밑줄치지 않은 부분의 염기쌍만을 가지고 Tm값을 계산하는건 아니죠?ㅠㅠ

2. 전체를 가지고 Tm값을 계산하면 너무 값이 커지는데 20bp 정도 되는 Forward Primer와 Reverse Primer 가 Reverse overlap Primer 그리고 Forward overlap Primer와 Tm 값을 어떻게 맞춰야되는지 궁금합니다. 

 

#overlap PCR
 
#overlapping PCR
 
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  05.30 16:01  

A와 B를 연결하기 위해 overlap PCR을 진행할 때

A의 끝부분에 B의 시작부분을 일부 만들고 B의 시작 부분에 A의 끝부분을

일부 만든 후 A + B 혼합하여 PCR을 하면됩니다.

따라서 A단편에 A-F/A-R(+B), B단편에 B-F(+A)/B-R을 사용하여 우선 증폭을

합니다.

그 다음 A + B를 혼합해서 PCR하면 됩니다.

다른 방법으로는 A단편 + B단편을 혼합 후 4종의 primer를 기준 농도보다

5분의 1정도 넣고 PCR하면 초기 증폭에서는 4종의 primer가 소비되고 이후

증폭에는 B가 붙어있는 A, A가 붙어있는 B가 primer로 작용하여 A+B가

증폭됩니다.

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