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레벨5
새슬
(과기인)
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20.05.29 06:51
파일입니다.
전기영동을 천천히 내려 보세요.
band가 퍼져 확인이 힘듭니다.
질문과 별개로 ligation 후 insert 여부를 확인하려면
miniprep까지하고 제한효소로 잘라서 확인하는 거 보다
colony pcr로 확인하는게 좋습니다.
하루 일찍 확인가능하고, 비교적 쉽게 많은 수의 colony에 대해 insert여부를 확인할 수 있습니다.
특히 pLKO.1은 shRNA plasmid라 insert가 약 60 bp 정도일텐데
empty vector랑 전기영동상에서 크기 차이를 확인하기 힘듭니다.
colony pcr로 colony 고른뒤 prep으로 plasmid 얻고
sequencing으로 최종확인하면 됩니다
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레벨5
새슬
(과기인)
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20.05.29 17:08
inset가 제대로 만들어졌는지 알려면 어떻게해야하나요?
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레벨5
새슬
(과기인)
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20.05.29 17:13
그리고 1~5번이 miniprep한 vector라면 supercoiled form이라서 6~10번이 더 위로 떠야되는 것 아닌가요?
insert로 쓴 oligo가 주문한 seq대로 만들어졌는지 확인하는 방법말씀이신가요?
colony pcr로 positive인 colony를 prep해서 마지막에 sequencing해봐야합니다.
저도 pLKO.1-puro 쓴 적있는데 colony pcr은
5 GAGGGCCTATTTCCCATG 3
5 CCATTTGTCTCGAGGTCGA 3
이 두 primer로 했습니다
insert가 제대로 들어가있다면 310-320bp 정도에 밴드가 나옵니다
그리고 oligomer랑 plasmid를 ligation하기전에
ds oligomer에 polynucleotide kinase 처리는 해주시고 있나요?
(미리 주문할 때 5' phospholyration도 해두면 불필요한 과정이긴합니다)
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새슬
(과기인)
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20.05.30 15:05
5' phosphorylation은 안했습니다.
근데 PCR을 해도 워낙 올리고가 58bp밖에 안되서 그냥 ligation된 거랑 차이가 날까요? dimerization 되었는지는 확인이 가능할 것 같습니다만...
제 밴드의 양상 상 다시 처음부터 하는 것이 낫겠죠?
처음부터 다시하셔야 겠네요
합성 DNA는 5' 말단에 phosphate가 붙어있지 않으므로
ligation insert로 쓸 때에는
주문할 때 옵션으로 넣던지 (가격이 비쌈)
직접 polynucleotide kinase (PNK)를 처리해 붙혀줘야 합니다.
(저렴한 T4PNK를 보통 이용)
안그러면 ligation 잘 안됩니다. (아마도 현재 트러블 원인 중 하나로 예상)
2% gel에 100bp ladder와 함께 내리면
200-300 bp에서 60bp 차이 구별 잘 됩니다
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새슬
(과기인)
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20.05.31 17:57
ligation은 T4 DNA ligase로 하고 있습니다.
그리고, 저희 랩에 다른 학생이 한 실험은 제대로 ligation이 되어서,
제가 안되는 이유가 설명이 안되고 있습니다.
그리고, oligo dimerization 이후에 4oC에 보관하고 있는데,
보관 온도는 적정했을까요?
한 달정도는 4도에서 보관해도 큰 문제 없습니다.
다른 학생도 똑같은 실험인가요?
합성 oligomer를 이용해 pLKO.1 plasmid에 넣는?
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새슬
(과기인)
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20.06.01 07:29
네 똑같은 실험입니다
올리고만 다른
같은 실험실 동료가 같은 프로토콜로 성공했다면
결국 질문자님 랩프로토콜 자체에는 큰 결함은 없는 것 같네요
이런 경우
그냥 같은 실험실 멤버에게 물어보는게 가장 빠를 것 같네요
재실험할 때 옆에서 좀 지켜봐달라던지 하셔야겠네요
아니면 질문자님의 모든 실험 과정을 미리 재확인받던지
Agarose Gel만드는 것부터 영동조건 등등
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레벨5
새슬
(과기인)
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20.06.04 16:33
colony PCR 결과 입니다.
저희 랩에서는 colony PCR은 안해서요...
N1 하나 건진 것 같은데, 그것도 2band 양상으로 보입니다.
nested 해 봐야 할까요?
2kb 정도에서 뜨는 저 밴드는 무엇일까요?