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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 shRNA vector miniprep
올챙이새슬(과기인)  | 05.28 17:09

pLKO vector에 oligo를 넣어서 shRNA 만든후,  

colony picking하여 miniprep을 하였습니다.

1~5 lane이 miniprep한 vector이고

6~10 lane이 vector를 EcoRI으로 1cut 한 것입니다.

(1&6, 2&7, 3&8, 4&9, 5&10 pair)

cut이 잘 안된건지..

아니면 vector 자체가 이상한 건지.. 잘 모르겟습니다.

한 번 봐주시면 감사하겠습니다.

 

 

 

#shRNA
 
#PLKO.1 vector
 
#enzyme cut
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  05.28 17:17  

사진이 없습니다.

올챙이새슬  |  05.29 06:51  
첨부파일 파일첨부: 1 cut.pptx (353 KB)

파일입니다.

대왕개구리SPEED  |  05.29 09:30  

전기영동을 천천히 내려 보세요.

band가 퍼져 확인이 힘듭니다.

개구리무광  |  05.29 15:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

질문과 별개로 ligation 후 insert 여부를 확인하려면

miniprep까지하고 제한효소로 잘라서 확인하는 거 보다

colony pcr로 확인하는게 좋습니다.

하루 일찍 확인가능하고, 비교적 쉽게 많은 수의 colony에 대해 insert여부를 확인할 수 있습니다.

특히 pLKO.1은 shRNA plasmid라 insert가 약 60 bp 정도일텐데
empty vector랑 전기영동상에서 크기 차이를 확인하기 힘듭니다. 

colony pcr로 colony 고른뒤 prep으로 plasmid 얻고
sequencing으로 최종확인하면 됩니다

올챙이새슬  |  05.29 17:08  

inset가 제대로 만들어졌는지 알려면 어떻게해야하나요?

올챙이새슬  |  05.29 17:13  

그리고 1~5번이 miniprep한 vector라면 supercoiled form이라서 6~10번이 더 위로 떠야되는 것 아닌가요?

개구리무광  |  05.29 18:23  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

insert로 쓴 oligo가 주문한 seq대로 만들어졌는지 확인하는 방법말씀이신가요? 

colony pcr로 positive인 colony를 prep해서 마지막에 sequencing해봐야합니다. 

저도 pLKO.1-puro 쓴 적있는데 colony pcr은 
5 GAGGGCCTATTTCCCATG 3
5 CCATTTGTCTCGAGGTCGA 3
이 두 primer로 했습니다 
insert가 제대로 들어가있다면 310-320bp 정도에 밴드가 나옵니다

그리고 oligomer랑 plasmid를 ligation하기전에
ds oligomer에 polynucleotide kinase 처리는 해주시고 있나요? 
(미리 주문할 때 5' phospholyration도 해두면 불필요한 과정이긴합니다)

올챙이새슬  |  05.30 15:05  

5' phosphorylation은 안했습니다.

근데 PCR을 해도 워낙 올리고가 58bp밖에 안되서 그냥 ligation된 거랑 차이가 날까요? dimerization 되었는지는 확인이 가능할 것 같습니다만...

 

제 밴드의 양상 상 다시 처음부터 하는 것이 낫겠죠?

 

 

개구리무광  |  05.30 15:26  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

처음부터 다시하셔야 겠네요

합성 DNA는 5' 말단에 phosphate가 붙어있지 않으므로 
ligation insert로 쓸 때에는
주문할 때 옵션으로 넣던지 (가격이 비쌈)
직접 polynucleotide kinase (PNK)를 처리해 붙혀줘야 합니다.
(저렴한 T4PNK를 보통 이용)
안그러면 ligation 잘 안됩니다. (아마도 현재 트러블 원인 중 하나로 예상) 

2% gel에 100bp ladder와 함께 내리면
200-300 bp에서 60bp 차이 구별 잘 됩니다

올챙이새슬  |  05.31 17:57  

ligation은 T4 DNA ligase로 하고 있습니다.

그리고, 저희 랩에 다른 학생이 한 실험은 제대로 ligation이 되어서,

제가 안되는 이유가 설명이 안되고 있습니다.

그리고, oligo dimerization 이후에 4oC에 보관하고 있는데,

보관 온도는 적정했을까요?

개구리무광  |  05.31 19:43  

한 달정도는 4도에서 보관해도 큰 문제 없습니다.  

다른 학생도 똑같은 실험인가요? 
합성 oligomer를 이용해 pLKO.1 plasmid에 넣는?

올챙이새슬  |  06.01 07:29  
네 똑같은 실험입니다
올리고만 다른
개구리무광  |  06.02 04:51  

같은 실험실 동료가 같은 프로토콜로 성공했다면
결국 질문자님 랩프로토콜 자체에는 큰 결함은 없는 것 같네요

이런 경우
그냥 같은 실험실 멤버에게 물어보는게 가장 빠를 것 같네요
재실험할 때 옆에서 좀 지켜봐달라던지 하셔야겠네요
아니면 질문자님의 모든 실험 과정을 미리 재확인받던지 
Agarose Gel만드는 것부터 영동조건 등등
 

올챙이새슬  |  06.04 16:33  
첨부파일 파일첨부: colony PCR 20200604.pptx (518 KB)

colony PCR 결과 입니다.

저희 랩에서는 colony PCR은 안해서요...

N1 하나 건진 것 같은데,  그것도 2band 양상으로 보입니다. 

nested 해 봐야 할까요?

2kb 정도에서 뜨는 저 밴드는 무엇일까요?

 

 

 

 

 

 

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