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 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문 plasmid DNA 제한효소 처리
알나의라임오렌지나무(대학생)  | 05.28 01:39

hTOX1 DNA를 pGEX4T-1 plasmid vector에 삽입하여 형질전환한 뒤에 alkaline lysis 로 DNA를 추출한 뒤 BamH1 제한효소를 처리하여 전기영동 한 결과입니다.

튜브 8개에 같은 DNA를 넣어주고 똑같이 반응시켜서 실험했는데 밴드가 다르게 나온 것도 있고  BamH1으로 잘렸으면 두개의 밴드가 나왔어야 하는데 1개의 밴드만 나왔어요ㅠㅠㅠ 이건 제한효소가 잘 처리되지 않아서 그런건가요?? 아니면 다른 이유가 있을까요??

그리구 왜 밴드의 크기가 2000bp정도로 나오게 된 건지도 모르겠어요. 제한효소가 처리 되지 않아서 밴드가 1개인거라면 pGEX4T-1 + hTOX1의 크기인 6568bp로 나와야 하는것 아닌가요??

upload_image

#DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  05.28 03:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일단 밴드가 하나인 걸 보니 다 잘 잘리긴 한 것 같습니다.

ladder의 2k 밴드보다 꽤 위에 있는 걸보니 2kb 정도가아니라 4kb 이상으로 추정됩니다만.
pGEX4T-1 plasmid는 사이즈가 4969bp네요. 질문내용으로부터 추정하면 hTOX1은 약 1600bp이고

hTOX1이라는 gene 을 앞뒤로 어떤 제한효소로 잘라넣으신건가요?
hTOX1을 앞뒤 둘다 BamH1 넣어서 넣은게 아니라면
3,8 lane이 hTOX1이 insert된거고 124567은 self ligation으로 추정되네요.

1.5%나 2% agarose gel에 내리신건가요?

벡터가 애초에 4kb가 넘으므로
ladder도 최대 10kb는 커버하는 ladder를 쓰시고
gel도 1% gel에 다시 내려보시길 권합니다.

대왕개구리강시  |  05.28 05:21  

4번 시료에는 500bp 배드가 하나 나왔네요.

대왕개구리SPEED  |  05.28 09:54  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. marker를 잘못 선정했습니다.

marker라는 것은 아무거나 사용하는 것이 아니라 sample의 분자량을 포함하는 범위에서 사용해야 합니다.

적어도 1kb ladder를 사용하여 다시 전기영동하는 것이 좋습니다.

2. 1, 2, 5, 6, 7은 잘리지 않았습니다.

3. 3은 insert가 없고, 4, 8은 insert가 있습니다만 4, 8은 insert가 있지만 insert 분자량이 다릅니다.

4. vector 대비 insert분자량이 작은 경우 plasmid양을 늘여서 제한효소를 처리해야지 insert를 확인하기 좋습니다.

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