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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot band
알5렌지(대학원생)  | 05.27 11:38

안녕하세요 western blot 연습중인 학생입니다.

10% gel 로 만들어서 단백질을 loading 하여 베타액틴을 확인하는 연습을 해보고 있습니다...

먼저 buffer 같은 시약들은 모두 판매되는 제품을 사용해서 이상이 없구요

가르쳐주시는 선생님과 같이 할땐 밴드가 나오는데 왜 혼자하면 밴드가 나타나질 않는지 너무 답답합니다..

같은 sample, 같은 방법으로 했는데 제가 혼자 하면 안돼요 ㅠㅠ

이번에 한 결과는 size marker 조차 퍼지고 색이 파란색으로 나왔습니다 (bio-rad)

antibody overnight 과정에서 색이 변한 것 같아요

또한 파란색 선이 보이구요 선은 SDS PAGE 과정부터 생겼습니다.

거의 4번째 밴드가 안뜨는데 너무 답답합니다..

베타액틴은 대충해도 그냥 나온다던데 왜 저는 안될까요..

도와주세요..

 

+ SDS PAGE 할때 베타 액틴 사이즈가 중간정도 와서 sample buffer 가 밑에 쯤 내려 왔을때 뺏습니다.(약40분120V) 그랬더니 중간부분 크기여야할 size marker 표시가 위에 위치했습니다. 1시간할땐 그러지 않았습니다. SDS PAGE 가 분자량에 따라 분리가 되는 건데 위에서 분자량에 따라 나눠졌을 텐데 running 시간이 짧아서 분리가 덜 됐다고 봐야할까요? 

#western blot
 
#band
 
#beta actin
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  05.27 17:32  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Gel도 스스로 혼자 만들었나요?

설명만 들었을 때에는
애초에 Gel이 제대로 안 만들어졌을 가능성이 가장 높아보입니다.

그리고 Transfer 했을 때, marker는 제대로 membrane에 옮겨졌나요?
아니면 ponceau s로 protein들이 제대로 transfer 됐는지 확인해보셨나요?

알5렌지  |  06.02 16:07  

 

gel 은 제가 만든 gel 을 다른 분이 사용하면 되는것으로보아..

밴드가 안나오는 이유는 아닐 것 같구요

transfer 했을 때 size marker 는 옮겨졌습니다.

3ug 의 단백질만 로딩했기 때문에 포슈 염색으로 보일 진 잘 모르겠네요..

 

 

답변 감사드립니다.!

 

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