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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 심하게 물러진 과실에서 RNA 추출 도움 부탁드립니다..
올챙이닉네임0115(대학원생)  | 05.26 18:29

안녕하세요, qPCR을 위해 RNA 추출을 하고 있는 대학원생입니다.

딸기 과실에서 RNA 추출을 하고있는데요, 

다른 것은 다 괜찮은데 심하게 물러진 과실에서 여러번 RNA 추출을 실패해서 비슷한 경험이 있으신 분이 있나 해서 질문 올립니다.

딸기에 회색 곰팡이를 접종한 뒤 25도에서 10일간 보관한 뒤 sampling을 했고, gene의 발현의 차이를 더 크게 보기 위해 접종 부위에서 RNA를 추출하고 있는데, 너무 물러져서 그런지, 세포가 죽어버려서 그런지 RNA가 전혀 추출이 되지 않습니다. 참고로 저희 실험실에서는 Ribospin RNA extraction kit Fruit and Seed를 사용하고 있습니다.

논문들을 보면 사실 sampling 방법이 잘 나와있는 논문이 드물기는 하지만 접종 부위에서도 잘 RNA 추출 하는 것 같은데....효율을 향상시킬 수 있는 방법이 있을까요?

감사합니다~

#RNA 추출
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  05.26 19:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
딸기의 물러진 부분은 DNA를 추출해봐도 거의 나오지 않습니다.
아마도 과육이 물러진다는게 조직이 파괴된다는 의미로 생각합니다.
DNA도 안나오는데 RNA가 많이 나올리는 만무합니다.
완전히 물러진 부위 말고 조금이라도 덜 물러진 부위를 샘플링해 보시지요.
꽃개구리느림보  |  05.27 07:40  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Pulp와 polysaccharides가 많은 성숙 과실은 컬럼으로 RNA 정제가 힘들어요. 조금 오래 된 전통적인 방법을 써야 합니다. Hot borate나 CTAB 방법을 먼저 해 보고. 정 안되면 마지막으로 hot phenol 추출법으로 해 보세요. 마지막이라고 한 이유는 효과는 좋으나 위험하기 때문입니다.
제 경험으로 완전히 물러진 멜론, 곰팡이에 감염되서 물러지는 중인 고추, 완전히 물러진 포도 알갱이에서 다 잘 나왔습니다. 죽어가는 세포일텐데도 RNA양은 상당히 많이 나와서 갸웃했었던 것 같습니다. rRNA와 tRNA밴드도 뚜렷이 분리되었고요. 그런데 양적 비율이 다른 조직과 많이 달라 보였습니다. 이 걸로 cDNA 라이브러리도 잘 만들었고, 노던블롯도 잘 나왔습니다. 딸기도 잘 뽑히기만 한다면 식물세포가 아니더라도 곰팡이 거라도 나오겠죠.
올챙이닉네임0115  |  05.27 09:34  

두 분 모두 감사드립니다!

CTAB method를 먼저 시도해본 뒤에 정 안된다 싶으면 덜 물러진 과실로 다시 해봐야겠어요ㅠㅠ

감사합니다!

올챙이닉네임0115  |  05.27 10:01  

느림보님 혹시 참고하셨던 CTAB method protocol이 있을까요..? 논문은 디테일이 다른 경우가 너무 많아서...쪽지 기능을 어떻게 쓰는지 모르겠어서 여기에다 여쭤봅니다ㅠㅠ

감사합니다!

꽃개구리느림보  |  05.28 11:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20200528_114229996.jpg (96 KB)
이미지 첨부파일

CTAB 방법의 기본은 Chang 1993입니다. 
이 자체로도 좋지만, 먼저 테스트로 몇개만 먼저 처리해 보고, 단계를 조금 수정해서 쓰는 것이 좋을 겁니다. 

1) Lysis 온도와 시간은 처리를 해 가면서 충분하다 싶을 정도로 조절해야 할 겁니다. 과실처럼 물기가 많은 조직은 얼려서 갈게 되면 얼음결정때문에 굉장히 힘이 듭니다. 이 때문에, 미리 잘게 조각을 내서 얼리기도 하죠. 하여간 갈린 정도와 수율은 비례하기 때문에 잘 갈아야 합니다 (저는 얼리지 않은 조직을 바로 비드를 넣어서 신속하게 갈고, 즉시 뜨거운 추출버퍼에 넣어서 비드비팅을 계속해준 경우에 최상의 결과를 얻었습니다). 

2) 중간 crude total RNA LiCl precipitation 후에, 젤에 걸어서 양과 품질을 확인한 후에 바로 EtOH wash를 하고 끝낼 것인지, 아니면 chloroform 추출 정제가 더 필요한지를 판단해서 수정할 수 있습니다. 그 이유는 chloroform 추출과 침전 회수 단계에서 수율이 많이 줄고, 또 시간이 길어지면 RNA 품질에 안좋기 때문입니다. 

3) polysaccharides가 많이 따라나오면 high salt 침전으로 상당히 해결할 수 있습니다. polysaccharides의 존재는 260/230이 대략 2가 안되는 경우에 짐작할 수 있습니다. 이때 pH 7.5정도로 맞춘 TE 버퍼에 2.5M NaCl나 0.2-0.3M ammonium acetate로 섞은 후에 cold ethanol을 넣어 -20도에서 몇시간 RNA를 침전시키는 겁니다 (파일 하나 첨부했습니다). 

4) 마지막으로, CTAB 방법은 LiCl 침전으로 RNA를 선택적으로 침전시키는데, 필연코 genomic DNA가 따라 나옵니다. 특히 샘플에서 비롯된 pH 변동이 생기는 경우 돌발적으로 많이 나오기도 합니다. qRT-PCR등의 용도라면 DNAse 처리를 꼭 하는 것이 좋겠습니다. 저는 Ambion의 TURBO DNA-free를 쓰고 있습니다. 

Chang S, Puryear J, Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol Biol Rep. 1993;11:113–116. doi: 10.1007/BF02670468.

 

 

올챙이닉네임0115  |  06.01 09:52  

열심히 따라해볼게요! 정말 감사합니다~:)

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