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Aligner는 선택할 수 있습니다. codon 단위로 정렬이 되어야 하니까 translational alignment를 지원하는 프로그램이면 되고, 수동으로 할 수도 있습니다. 예를 들면, BioEdit 프로그램에서 toggle translation을 시킨 후 clustal 정렬을 하고, 이것을 다시 DNA 서열로 back-translation 시키는 방법도 가능합니다. 하지만 서열이 길거나 다형성이 높은 경우 편향이 생길 수 밖에 없는데, 수작업이 불리하기 때문에 일관적인 규칙을 적용하는 프로그램을 사용하는 것이 좋습니다. Transalign 프로그램이 일반적이고, clustal-omega나 mafft 같은 정렬프로그램을 변형해서 응용하는 방법도 있습니다.
단순히 dN/dS를 구하는 거라면 tree 파일은 없어도 됩니다. DnaSP 프로그램에서도 구할 수 있고, paml의 YN00 프로그램을 사용하면 됩니다. input은 그냥 phylip 형식의 정렬파일입니다.
그렇지만 selection이나 특정한 서열 변화를 평가하려면 tree 파일이 있어야 합니다. paml의 CodeML에서 보통은 ML 분석에서 얻은 best tree를 넣습니다. 출판된 논문들에서는 자세히 밝히지 않은 따로 지정해야 하는 옵션이 많기 때문에 꼭 매뉴얼을 통독하고 하세요. 대충 했다가는 리뷰어들한테 크게 깎입니다.
paml 프로그램에 익숙하지 않다면, paml은 GUI 인터페이스인 pamlX, CodeML 프로그램은 간단한 GUI 프로그램인 EasyCodeML가 편할 겁니다. 둘 다 윈도우에서도 돌아갑니다.