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레벨5
BlackSmile
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20.05.21 12:21
1. SDS-PAGE gel의 농도는 몇 %인가요?
2. Transfer buffer에 methanol이 첨가되어있나요?
3. 사진 속 Ladder의 각각의 size는 몇 kDa인가요?
4. Sample loading할 때 protein양은 몇 ug을 loading했나요?
5. Antibody 붙인 후 washing은 어떻게 진행하셨나요?
150kDa라면 gel %를 낮춰서 진행해보 시면 될 겁니다. 7%정도 혹은 5%정도면 될 거고....
문제는 결과인데, 하얀색이 저는 band로 보이지는 않습니다.
western blot에 대해 공부하셨다면 아시겠지만, 형광을 띈 antibody가 target protein에 붙어서 develope과정에서 film을 태우는 것인데, 일반적으로는 흰색으로 film이 타지 않죠.
우선 sample 부터 다시 만들어 보시는 것을 추천드립니다.
marker가 잘 분리되어있는 것을 보면 젤의 문제는 아닌 것 같습니다.
만약 sample을 다시 만드신 뒤에도 저런 문제가 생긴다면, 1st antibody의 농도를 더 낮게 희석을 하신뒤에 사용하시는 게 좋을 것 같습니다.
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지나가다..
(비회원)
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20.05.21 14:53
마커는 잘 되었죠? 그렇다면 gel이나 transfer상에서 문제는 없습니다.
저렇게 나오는 이유는
1) 샘플의 농도가 너무 높을때, 제대로 분리가 안되는거죠..
2) 샘플이 denaturation이 제대로 되지 않은 경우, sample buffer넣고 boling 하셨나요?
3) 샘플이 degradation되었을때, 단백질이 다 조각나버린 경우입니다.
3개중 하나입니다.
아울러, western blot에 대해서 공부를좀 하셔야겠네요.
일반적으로 기기를 보시면 C.V 또는 C.A라고 적혀있거나 Const V, Const A라고 적혀있는데요.. 이거 의미부터 공부하시고, western 조건 잡으세요. 저거에 대한 이해가 되면 위에처럼 'sds page 는 160v 300mA 60 min , transper 는 30v 400mA 120min' 라고 못적습니다.
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레벨1
연구원0
(과기인)
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20.05.21 18:34
답변해주신분들 감사합니다.
질문을 하는데 정보가 좀 부족했던점 사과드립니다.
겔은 6%입니다.
확인마커는 위에서부터 245,180,135 입니다.
기계는 CC 인것같습니다. 전류 고정에 전압이 시간에 따라 변동되서 그렇게 생각됩니다.
같은조건으로 다른 밴드를 보면 잘나오는데,
유독, 100 이상 밴드를 보려고 하면 안나오네요...그렇다면 samplebuffer 에의한 변성은 이루어졌다고 생각됩니다.
지금으로선 샘플이 이상하다 생각해서 lysis 버퍼를 바꾸어서 효율을 높이거나 하고있지만.. 그거역시 아닌방법같아 고민중에있습니다.
연구실에 선배가 없어 물어보거나 배울수가 없어 무지인체로 질문드렸습니다; 죄송합니다