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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 cell counting 질문
알기댕이(대학생)  |  05.18 18:02
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20200518_175827847.jpg (161 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 cell counting에 대해 여쭤보려고 합니다

요즘 96well에 시딩 연습을 하고있습니다. 물질처치 안하고 흡광도만 측정합니다

보통 control에서 흡광도가 0.3~0.4 정도가 나온다는데 저는 10번 가까이 연습했는데 0.1~0.2~ 정도 밖에 안나옵니다. 계속 그렇다는것은 셀 카운팅이 잘못되어 계속 적게 시딩 되고 있는거 같은데 확인좀 부탁드립니다 ㅜㅜ 

사진처럼계산판 판의 가운데 격자무늬 의 모서리와 가운데 총 5부분을 세고 곱하기 5를 해줍니다. 솔직히 원리는 잘 모르겠습니다.. 맞는건가요?

세포는 트립신으로 떼고 원심 돌려준후 상층액 버리고 다시 배지 1ml로 피펫팅 후거기서 10ul 취해서 카운팅 한것입니다 염색은 하지 않았습니다.

그러고 다시 원심 돌린후 필요한배지+세포든 1ml에서 따서 섞어서 만들어 시딩합니다.

#cell counting
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
해브어굿타임  |  05.19 13:13   

그렇게 5부위를 세준 후 x5 해주고 

여기에 희석배수도 같이 곱해준 후 10*4를 해줘야 cells/mL가 나오구요

 

트립신 처리를 하면 트립신과 동량의 cell culture media를 넣어줘서

트립신의 작용을 억제해준 후 원심분리 ~~로 그대로 진행하시면 됩니다.

간단하게 설명하자면은...  |  05.22 14:41   

*5를 해주는 이유는 원래는 그 네모 25개를 다 세야는데 다 세기번거로우니 랜덤하게 5개만 고른뒤 *5를 해주는 겁니다.

그럼 원리를 설명하자면 25개의 네모가 차이하는 부피가 가로 세로가 각각 0.1mm이고 높이가 0.01mm 입니다. 이게 부피로 계산하면 10-4 mm3이지요  mm3는 1ml이잖아요 (오랜만이라 헷갈리네요 요새는 그냥 counter machine을 사용하는지라...)

원리는 어쨋든 저 10-4 mm3 안에 내가 count한 세포가 몇개 들어 있으니 x개의 세포를 얻기위해서는 세포가 희석된 메디어 (당연히 셀카운팅한 메디어..)에서 몇 ul를 취해야 하는지를 계산하는겁니다. 아마 그냥 실험실에서 만들어둔 공식으로 외우셔서 각각 대입할테니 단위환산이 맞지 않는다면 찾아보시구요 무튼 원리는 저러합니다. 왜 104라는 숫자가 나오는지만 알면 전체 원리를 알수 있습니다. 간단한 비례식입니다. 

그리고 다시 원심분리 하지 마시고 잘 파이펫팅만 해주신후에 필요한 용량만 취해서 원하는 well에 seeding하시면 됩니다. 총 volum은 세포가 들어 있지 않은 메디어로 맞추어 주면되구요...도움이 되셨길...

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