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질문 E.coli에서 MBP fusion 효소 발현 시 발현 문제
알효소석사생(대학원생)  |  05.18 16:05
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20200518_155830584.png (240 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요! 현재 Lactobacillus 유래의 효소를 MBP와 재조합하여 E. coli에서 발현 시키는 실험을 하고 있는 석사생 입니다. 효소는 domain truncation이 된 상태이고 N-term 쪽에 MBP, C-term 쪽에 6x His tag이 연결되어 p6xHis119 vector에 cloning 되어있습니다.

Construction된 plasmid를 pRARE plasmid가 들어있는 E. coli MC1061에 transformation해서 발현 시키고 있구요.

현재 문제점이 많지만 가장 문제라고 생각 되는 점이 발현이 잘될 때는 엄청 잘 되는데 같은 조건으로 키워도 잘 안될때가 있다는 것입니다.

현재 배양 조건은 항생제 넣은 LB 배지에 접종하여 37도에서 OD 1.5까지 키우고 18도 인큐베이터로 옮겨서 16시간 배양하여 harvest를 진행합니다. 지금까지 테스트 해본 것 중에서는 이 방법이 가장 발현이 잘 되는 것 같아서 이 방법으로 배양을 하고 있는데 가끔 키웠는데 발현이 안돼있으면 맘 아프더라구요.. 혹시 짐작가는 이유가 있으시면 조언 부탁드립니다!

사진은 왼쪽이 안될때, 오른쪽이 잘될때구요 Ni-NTA 정제 후에 프랙션을 SDS-PAGE로 본 것입니다.

#효소
 
#발현
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리SCIENTIST00  |  05.18 18:39  
IPTG induction 지점이 상당히 늦기때문에 쎌의 상태에 따라 오락가락할 수 있습니다. Log phase에서 진행하면 어떤지 홥인해볼필요가 있습니다
대왕개구리SPEED  |  05.18 22:18  

사용한 vector의 promoter가 어떤 종류인가요?

알효소석사생  |  05.19 14:51  

답변 감사합니다!

IPTG induction은 따로 하지 않고 OD 1.5에 도달하면 온도조건만 바꿔서 진행하고 있습니다.

Vector의 promoter는 BLMA promotor 입니다!

답변하기
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