실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
펩타이드 정제 후
레벨4 졸업은언제하나 (대학원생)
안녕하세요! 펩타이드 발현 정제 중인 학생입니다.
SPEED님께서 기억하실지는 모르겠지만..
네...저 그 펩타이드 정제 후 문제를 해결하지 못 했습니다...ㅠ ㅠ
제가 중간에 개인적인 일과 다른 실험이 있어서, 펩타이드 정제 관련 실험 진행과 백업이 늦었습니다.
제가 6xHis tag 펩타이드 2가지를 E.coli로부터 발현 정제를 진행하였습니다.
타겟 펩타이드 1과 2를 IMAC으로 정제 하다가,
타겟 2 펩타이드가 완벽하게 정제가 되지 않거나 사려져버려서....3월달에 이곳에 문의를 올렸었습니다.
그 때 타겟 펩타이드2 에서의 문제가 IMAC 정제시 정제한 펩타이드 이외에도 다른 크기의 펩타이드 들이 생기며 (그림에 ③), filtration과정에서 타겟 펩타이드 손실이 일어나는 것이었습니다.
발현과 정제시 사용했단 sodium phosphate/NaCl 버퍼 대신 20 mM Tris-HCl 버퍼로 변경을 해보았었는데,
버퍼 내 펩타이드 양이 낮아지고, IMAC으로 single band로 정제할 수 없었습니다 (이전과 같이 타겟밴드 이외에도 더 작은 분자량을 가지는 밴드들 확인).
제 펩타이드1, 2가 protein A에 결합하는 도메인을 가지고있어서, protein A 컬럼으로 정제해보는 것이 어떻냐는 지도교수님 제안에 Protein A 컬럼으로도 정제를 진행했습니다.
전체 실험은
1. Bl21(de3)과 pET-23a를 이용하여 c-말단 6xHis tag 펩타이드 1,2 를 발현
2. E. coli cell을 모아 50 mM Na-phosphate buffer/300 mM NaCl buffer에 suspension (1L 배양액당 20 ml 버퍼로 suspension) 후 lysis
3. lysis한 상층액을 분리하여 정제 진행
(정제 전 SDS-PAGE와 WB로 확인- 그림에서 ②)
4. Protein A 컬럼으로 정제
- running buffer: 50 mM Na-phosphate buffer/300 mM NaCl buffer
- elution buffer: 100 mM Tris-HCl, pH 3.0 (컬럼 권장)
+ neutralization 1M Tris-HCl pH 9.0 ( elution buffer 1ml 당 100 ul)
5. Speed vac 으로 농축
6. 3K amicon으로 버퍼 교체 (2번 진행)
교체될 버퍼: HBS-EP 버퍼 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)
7. SDS-PAGE (그림의 ①)
그런데 여기서 확인한 문제가
정제한 직후 바로 SDS-PAGE를 진행하였을 때에는 타겟 밴드 이외에 다른 밴드가 없었습니다 (그림의 ④).
그런데 펩타이드2번을 정제 후 냉동고에 얼렸다가, 녹여서 농축 진행 후 amicon으로 버퍼 교체 (HBS-EP 버퍼) 후 냉동 보관 하였을 경우 (그림의 ⑤)
혹은 정제 후 4℃에 하루동안 보관시 (그림의 ①)
---> 다음날 SDS-PAGE를 내리면 target 밴드 이외의 다른 밴드들이 생기는 것을 확인했습니다 .
(그림의 5번에서 1, 2번 레인은 WB 진행 중)
ㅠ ㅠ
현재 문제가 다음 두 가지인데,
펩타이드 1: 타겟 펩타이드1의 완벽한 정제 (MS 분석용)
---> IEC로 추가 정제 진행 중
펩타이드 2: 왜 자꾸 타겟이외의 작은 밴드가 생기거나 농축-버퍼 교체 과정에서 펩타이드가 사라지는지......
서열상으로 펩타이드 2번 서열은 펩타이드1번 서열+추가 서열+C말달 6xHis의 구조를 가지고 있는데, 왜 이런 문제가 발생하는지 모르겠습니다 ㅠㅠ
특히, 버퍼 교체를 진행하면 타겟밴드가 하나도 없는데...
이런 경우엔..어떻게 해야하는 걸까요...ㅠ ㅠ
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