실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > etc.
RNA-seq 결과와 Realtime PCR 결과가 다릅니다.
레벨2 이피 (대학원생)
Control과 처리군 각각 5개씩 RNA 샘플을 만들었고,
RNA-seq 분석을 의뢰할 때에는 5개의 샘플을 pooling해서 Control과 처리군 각각 1개의 샘플로 분석의뢰를 진행했습니다.
이후 5개의 샘플 각각을 cDNA 합성을 진행해두었습니다.
RNA-seq 결과, 처리군에서 유의하게 감소하는 유전자가 있어 cDNA 합성한 샘플들로부터 해당 유전자에 대한 Realtime PCR을 진행하였는데, 유의하지 않게 나왔을 뿐더러, 오히려 조금 증가하는 듯한 경향을 보였습니다.
이에 어떤 결과를 중점으로 두고 있어야 할지 모르겠습니다.
Realtime PCR 결과 분석은
gene - rpl7(housekeeping gene) Ct값 (A)을 구한 뒤
A에서 평균값을 빼 주고 (B),
엑셀에서 Power를 통해 최종 값을 구했습니다 ( = Power(2,-B)).
계산방식이 잘못된 걸까요?
그런데 계산방식은 이전에도 똑같은 식으로 진행하였기에 어떤 게 문제인지 모르겠습니다.
primer는 미리 gradient PCR을 통해 multiband가 뜨지 않는 최적의 온도를 확인하였고 (실제로 어떤 온도에서도 multiband가 뜨지는 않았습니다), real-time PCR에서 melt curve를 확인할 때에도 이상이 없었습니다.
발현량도 낮지 않았구요 (Ct값이 평균 22로 잡혔습니다)
이런 경우 데이터를 어떻게 확인해야 할까요..?
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