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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 cloning과 Transformation 관련 질문 드립니다.
알초급실험몬(대학생)  | 04.23 13:18

안녕하세요 protein evolution 실험중인 학부 연구원입니다.

현재 타 균주의 dna를 E.coli에서 genework 하기 위해 옵티마이즈 해서 Gene Synthesis 주문을 한뒤 puc19 벡터를 이용해 E.coli DH5a에서 형질전환을 하고 있습니다.

주문한 gene Synthesis product를 PCR로 증폭하여 벡터에 ligation 후 transformation 한뒤 유전자가 들어있는지 확인 후 시퀀싱을 보냈는데 계속 특정 부분(G가 5개 연속된 서열, T가 6개 연속된 서열)에서 결실이나 변이가 확인됩니다.

upload_image

PCR enzyme 을 Tag에서 Pfu로 바꿔봐도 동일합니다.

혹시 이러한 연속된 dna 서열이 PCR할때 또는 E.coli 내에서 mutation이 발생하게 되나요??

 

#PCR
 
#변이
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.23 13:44  

합성한 DNA 양과 길이가 얼마나 되나요?

유전자 합성이 잘못된 것 같습니다.

알초급실험몬  |  04.23 14:06  

SPEED님 답변 감사합니다 ㅜ

일단 합성한 DNA 길이는 810bp 이고 DNA 합성이 잘못된거 같지 않은게 지금까지 8개 정도 샘플을 만들어 시퀀싱을 보냈지만 Mutation이 일어난 부위는 전부 다 달랐습니다... 공통점이 있다면 위 글에서 말한거 처럼 특정 서열이 4~6개정도 반복된 부위에서 일어났습니다

대왕개구리SPEED  |  04.23 14:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

DH5a를 몇십년 사용했지만 질문과 같은 현상은 없었고 일어나지 않는 균주입니다.

합성 양이 된다면 direct sequencing 해봐도 되고 양이 적으면 PCR 증폭 후 정제해서 cloning 하지말고

sequencing 해보세요.

문제가 생기면 의심되는 문제를 하나씩 해결해야 합니다.

우선 합성 DNA 서열의 confirm을 하고나서 이후 문제를 해결해 보세요.

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