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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 His-tag purification TEV protease cleavage 실패 원인 질문
알바캠(대학생)  | 04.14 13:47

저는 지금 His-tag purification 실험을 하는 중입니다. 1st nickel purification으로 protein of interest을 수집 하고 desalting chromatography를 한 후 TEV protease를 넣어 overnight incubation을 했습니다.

그러고 난 후 그 다음 날 post TEV sample을 채취하고 2nd nickel purification을 하여flow through를 수집하고 버퍼(250 mM imidazole)를 사용하여 wash 한 후 또 샘플을 수집 했습니다. 그리고 SDS-PAGE를 이용해 cleavage 가 잘 되었는지 확인을 하는데 이상하게도 항상 flow through 샘플에 TEV protease 밴드가 보입니다. 그리고 eluted sample에는 정작 TEV protease 밴드가 보이지 않고, 심지어 프로틴 밴드가 보일 때도 있습니다. 그러고 나서 gel filtration을 flow through sample 로 농축하여 돌리면 protein aggregation peak 과 protein peak 둘 다 항상 보입니다. 

 

cleavage가 안된걸까요? 왜 TEV protease가 flow through에 가끔씩 검출되고 eluted sample에서는 검출 되지 않는건가요? 

#his-tag purification
 
#TEV protease
 
#SDS-PAGE
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