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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 사용하시는 분 계신가요?
개구리아이스티(과기인)  |  04.09 18:29

고마바이오텍의 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 제품을 사용하려고 하는데 혹시 이 제품을 쓰시거나 다른 회사의 제품이라도 Annexin V/PI staining을 하신 분들께 여쭤보고 싶은게 있습니다.

  1. 분석하고자 하는 세포를 약1x106cells/ml로 준비한다.
  2. 0.5ml의 세포 현탁(5x105cell/ml)을 microtube로 옮긴다.
  3. 1000 x g로 5분간 상온에서 원심 분리하여 배양액을 제거한다.
  4. 차가운 PBS 0.5ml로 세포를 부드럽게 풀어준다.
  5. 1000 x g로 5분간 상온에서 원심 분리하여 PBS를 제거한다.
  6. 차가운 1x binding buffer 0.5ml로 세포를 부드럽게 풀어준다.
  7. 1.25ul의 annexin V-FITC를 가한다.
  8. 반응물에 빛을 차단하고 상온에서 15분 반응시킨다.
  9. 1000 x g로 5분간 상온에서 원심 분리하여 상층액을 제거한다.
  10. 차가운 1x binding buffer 0.5ml로 세포를 부드럽게 풀어준다.
  11. 10ul의 propidium iodide를가한다.
  12. 반응물을 빛을 차단하고 냉장 보관한다 (4℃)
  13. 빠른 시간 내에 유세포분석 (flow cytometry)또는 형광현미경으로 분석 한다.

이게 해당 키트의 프로토콜인데요.

따로 Fixation 과정이 없다보니 실험하기가 좀 번거로울거 같더라구요. formaldehyde or ethanol fixation을 한다면 샘플들 모았다가 한번에 PI staining하면 좋을 것 같거든요.

annexin V 처리 후 따로 fixation이 가능할까요?

그리고 PI의 경우 DNA 뿐만 아니라 RNA도 detection하기 때문에 PI staining을 할 때 RNase도 같이 처리하는 것으로 알고 있습니다. 그런데 이 키트에는 RNase가 포함되어 있지도 않고, 따로 처리하라는 말도 없어서 의문이 들더라구요.

RNaseA를 따로 처리하는 게 좋을지, 그렇다면 어느 과정에서 처리해도 되는지 아시는 분 계실까요?

#annexin v
 
#PI
 
#facs
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
111  |  04.10 00:03   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Annexin-V는 세포막인 인지질에 있는 phosphatidyl serine에 붙는 것이기 때문에 fixation을 따로 해주면 안되는 것으로 알고 있습니다.. 
(말씀하신 fixative들은 인지질 성분을 녹일 수 있는 유기용매이니까요..)

따라서 fixation을 해주지 않으니 PI는 살아있는 세포가 아닌 죽은 세포의 DNA만 염색할 수 있을 것이니 RNase를 굳이 할 필요는 없겠지요.. 

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